Blue Native PAGE凝胶电泳常见问题

Blue Native PAGE凝胶电泳常见问题

1. 在非变性条件下，使用Blue Native PAGE凝胶进行非变性电泳比使用Tris-甘氨酸凝胶具有哪些优势？

需要使用非离子洗涤剂进行增溶的样品不能兼容传统的非变性Tris-甘氨酸PAGE，因为随着蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移，会将非离子洗涤剂遗留在条带上方。当缺少非离子洗涤剂时，蛋白质会聚集并在泳道顶部形成垂直线条。当使用蓝色非变性电泳（Blue Native PAGE凝胶）时，Coomassie G-250可显著减少蛋白质的聚集，有效分离膜上的蛋白质复合物，达到Tris-甘氨酸凝胶上得不到的效果。此外，与Tris-甘氨酸系统的工作pH（pH 9.3–9.5）相比，Blue Native PAGE凝胶较低的工作pH（pH 7.5–7.7）有助于维持碱性pH敏感型蛋白质的非变性结构和/或活性。

2. Blue Native PAGE凝胶应如何保存？

我们推荐将其保存在4-8℃。不可冷冻。

3. Blue Native PAGE凝胶的蛋白分离范围是多少？

3-12%RealPAGE Native BN/CN 预制胶可分离分子量在45–10,000 kD范围内的蛋白质。

4-16%RealPAGE Native BN/CN 预制胶可分离分子量在25–10,000 kD范围内的蛋白质。

4. Blue Native PAGE凝胶的推荐样品上样体积和蛋白质上样量是多少？

我们提供的预制胶是12孔，每个孔的最大上样体积为30 μl，推荐每个泳道的蛋白含量范围在20-50 μg。

5. 我的Blue Native PAGE凝胶在电泳过程中停止电泳了,为什么？该如何继续电泳？

在Blue Native PAGE凝胶电泳期间，电流下降至低于1 mA很常见。有些电泳电源如伯乐电源有负载检查功能，电流过低（低于4mA） 会认为没有负载，报错E1错误代码，终止电泳。解决方法是更换电泳电源，如使用国产电源；另外可以调高电压高于300 V，使得电流不要低于4mA。

推荐使用RTD6137 非变性电泳蛋白质Marker（45-880 kD），RTD6142 高分子量非变性电泳蛋白质Marker II（45-669 kD）或者RTD6144 宽分子量非变性电泳蛋白质Marker 21-880 kD。然而由于凝胶浓度较低，低于45 kD条带会压在前沿，可能不可见。

在Blue Native PAGE电泳中，不能使用预染分子量Marker，因为所有的预染蛋白分子量Marker都是经过变性和还原的，在非变性凝胶上不能良好分离。

请注意，即使使用非变性分子量Marker，在非变性电泳中的分子量预估也是非常不精确的，因为各蛋白质的不同电荷和结构会严重影响凝胶迁移。为获得更精确的预估，可使用质谱分析或排阻层析（SEC）。

7. 你们推荐对Blue Native PAGE凝胶使用哪种染色方法？

Blue Native PAGE凝胶可兼容大多数标准Coomassie R-250或G-250染料配方。推荐使用FastBlue蛋白染色液（货号：RTD6202）。

8. 5% G-250染料的作用是什么？是否含有洗涤剂？

5% G-250染料（货号BC260）是一种浓缩型Coomassie G-250储液，专为与含有洗涤剂（非离子型）的Blue Native PAGE凝胶电泳样品一起使用而设计。该染料不含洗涤剂。正常情况下，非变性蛋白在凝胶上的迁移取决于凝胶缓冲液pH下的自然电荷/等电点，但是，加入Coomassie G-250会使蛋白质产生负电荷，即使是通常具有正电荷的高pI蛋白质也能带上负电。该添加剂能够与蛋白质非特异性结合，能够保持蛋白的非变性状态。

9. 你们推荐选择哪种转膜缓冲液用于Blue Native PAGE凝胶转印？

我们推荐选择10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）用于Blue Native PAGE凝胶转印。PVDF是推荐使用的印迹膜，具有良好的转印和检测效果。硝酸纤维素膜（NC膜）不能兼容Blue Native PAGE凝胶转印，这是因为硝酸纤维素膜可与Coomassie G-250染料发生紧密结合，很难脱离干净。

10. 对于Blue Native PAGE凝胶，你们推荐的转膜条件是什么？

由于Blue Native PAGE电泳基本关注的是分子量比较大的蛋白或复合体，推荐使用湿转法转膜，不推荐用半干转方法转膜。使用BN转膜缓冲液，以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。

11. 凝胶转膜后，我的PVDF膜染上蓝颜色了怎么办？

由于电泳缓冲液和上样缓冲液中含有考马斯亮蓝G-250，凝胶转膜后PVDF膜会有蓝色痕迹，可以把膜浸泡在无水甲醇中漂洗几分钟，去除蓝色。

12. 非变性Marker转到膜上看不到条带，Western Blot检测后我如何判断条带大小呢？

有两种方法可以解决非变性Marker转膜后条带显示问题：

第一种方法：凝胶转膜后用丽春红染色液（货号：RTD6301）染膜，可以看到Marker条带，顺便可以检测转膜效率，然而要注意的是丽春红染色灵敏度比较低，可能不能完全看到完整的Marker条带。

       注：北京师范大学惠赠图片

第二种方法（下图）：电泳结束后，把含有Marker泳道的凝胶切下，单独用考马斯亮蓝染色液染色（货号：RTD6202），剩余的凝胶去完成转膜到ECL发光检测过程，最后的发光结果和Marker染色结果拼接判断条带范围。