Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
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货号
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名称
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包装
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RTD6140
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Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(手灌胶)
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10 次
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● 货品内容：
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组份
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货号
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名称
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规格
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保存
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1
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RTD6140-01
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2×BN/CN凝胶缓冲液
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40 ml
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4℃
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2
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AC2914-30ml
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40%
PAA（29:1）
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30 ml
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE电泳缓冲液(干粉)
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500 ml
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RT
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3
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PL114-01
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4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（电泳用）
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20 ml
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4℃
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5
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BC260-01
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5% G-250染料（上样用）
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1 ml
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4℃
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6
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SR0510
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浓缩胶红色添加染料(200×)
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0.5 ml
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RT
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7
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT(配制后-20℃贮存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃ 避光
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9
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说明书
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一份
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● 产品简介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白(pI＜7)；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。
本产品包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。
试剂盒配套有红色浓缩胶添加染料,凝固后的浓缩胶为红色,有利于在蓝色电泳缓冲液中观察加样孔,方便上样。
本试剂盒大约可以配制8-25块常规大小（8×10 cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶浓度和厚度决定，1 mm厚度8%凝胶可以配制至少10块胶。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。
● 使用说明：
一. 样品制备：
该试剂盒不含样品制备的相关试剂，根据样品种类，具体选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒（货号：RTU5002）；动物总蛋白BN样品制备可以选择动物胞浆活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂，离心柱法）（货号：RTD8106）；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒(细胞)（货号：RTD8111）和动物膜蛋白提取试剂盒(组织)（货号：RTD8112）；动物线粒体BN样品制备可以选择动物细胞线粒体提取试剂盒（货号：RTD8115）和动物组织线粒体提取试剂盒（货号：RTD8117）。
二. 制胶：
2.1 分离胶制备：
2.1.1 不同浓度的分离胶的最佳分离范围：
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分离胶浓度
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最佳分离范围
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6%
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80-500 kD
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8%
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50-350 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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2.1.2根据表一，将不同体积的成分在小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡
2.1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
2.1.4静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表一 Blue/Clear Native PAGE分离胶配方表
（以一块1.0 mm厚度mini胶为例）
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分离胶总体积 5 ml
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6%
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8%
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10%
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12%
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15%
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组份
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组份加入体积（ml）
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灭菌水
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1.7
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1.45
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1.2
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0.95
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0.57
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2×BN/CN凝胶缓冲液
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
|
2.5
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40％ PAA（29:1）
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0.75
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1
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1.25
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1.5
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1.875
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10％ APS
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0.05
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0.05
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0.05
|
0.05
|
0.05
|
|
TEMED
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0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
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2.2 浓缩胶制备：
2.2.1去除覆盖在分离胶上的水层。
2.2.2按照表二将不同成分在一个小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
2.2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
2.2.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
2.2.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表二 Blue/Clear Native PAGE浓缩胶（4%）配方表（以一块1.0mm厚度mini胶为例）
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组份
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不同凝胶体积对应各组份的取样量
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浓缩胶总体积2 ml
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H2O
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0.8 ml
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2×BN/CN凝胶缓冲液
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1 ml
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40％ PAA（29:1）
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0.2 ml
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浓缩胶红色添加染料(200×)
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10 μl
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10％ APS
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20 μl
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TEMED
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2 μl
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三. 电泳：
3.1 准备电泳缓冲液：
将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
3.1.1 CN-PAGE电泳：
阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。
3.1.2 BN-PAGE电泳：
阳极缓冲液(外槽)使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液(内槽)按照下表配制：
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1×蓝色阴极缓冲液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE电泳缓冲液
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15
ml
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2% G-250 染料（电泳用）
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1.5 ml
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超纯水
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定容至150
ml
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3.2 准备样品：
3.2.1 CN-PAGE电泳：
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总体积
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10
μl
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蛋白样品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液
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2.5 μl
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超纯水
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补至10 μl
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|
|
不要加热
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3.2.2 BN-PAGE电泳：
3.2.2.1
植物类囊体膜蛋白电泳：
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总体积
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10
μl
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含去垢剂样品*
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植物类囊体膜蛋白样品
（2%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液
|
2.5 μl
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5%
G-250染料（蛋白上样）
|
1 μl
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超纯水
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补至10 μl
|
|
|
不要加热
|
*植物类囊体膜蛋白电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：
植物类囊体样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。例如样品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%，则需要G-250终浓度为0.5%。10 μl蛋白样品中需要加5%
G-250染料1 μl。
3.2.2.2
动物线粒体BN样品电泳：
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总体积
|
10
μl
|
|
|
含去垢剂样品*
|
|
动物线粒体BN样品
（1%DDM增溶）
|
x μl
|
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液
|
2.5 μl
|
|
5%
G-250染料（蛋白上样）
|
0.25 μl
|
|
超纯水
|
补至10 μl
|
|
|
不要加热
|
*动物线粒体BN样品电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：
动物线粒体BN样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/8。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.125%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
3.2.2.3
不含去垢剂样品：
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总体积
|
10
μl
|
|
不含去垢剂样品
|
x μl
|
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液
|
2.5 μl
|
|
5%
G-250染料（蛋白上样）
|
- #
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超纯水
|
补至10 μl
|
|
|
不要加热
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# 不含去垢剂样品可以不必添加5%G-250染料。
3.3电泳过程；
3.3.1 CN-PAGE电泳：
电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
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CN-PAGE电泳
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恒电压
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起始电流
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结束电流
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电泳时间
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120V
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10-15mA/板胶
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4-10mA/板胶
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50+min
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注：冰浴电泳
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3.3.2 BN-PAGE电泳：
BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达距离凝胶顶部2/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。
BN-PAGE电泳条件（一板胶）
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恒电压
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起始电流
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电泳时间
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缓冲液
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×蓝色阴极缓冲液
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冰浴电泳
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指示前沿至凝胶顶部三分之二处，更换内槽缓冲液为无色1×BN/CN
电泳缓冲液
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恒电压
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继续电泳时间
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结束电流
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缓冲液
|
|
|
120 V
|
45 min
+
|
3-5 mA
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1×BN/CN电泳缓冲液
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冰浴电泳
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四. 转膜：
BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密。
转膜缓冲液可以使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。
五. 染色：
5.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
5.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
5.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
5.4 观察保存结果。
六. 实验示例：
RTD6140 Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶） WB检测
样品处理：K562悬浮细胞提取胞浆活性蛋白（货号：RTD6106 动物活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂））
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：PL114） 调整蛋白浓度为1μg/μl上样液，梯度上样5-20μg
电泳：8% BN手灌胶，稳压200V 1×蓝色阴极缓冲液至指示前沿距离胶上沿2/3处，
更换为无色1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，电泳时间共83分钟
转膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）稀释为1×BN转膜缓冲液加20%甲醇，
恒流200mA 2小时，未冰浴。
转膜效果检测：膜用丽春红染色液染色（货号：RTD6301）有可见条带，胶用FastBlue蛋白染色液染色
（货号：RTD6202）几乎无条带，证明转膜成功。膜用无水甲醇清洗5分钟去除膜上蓝色残余。
封闭：Western快速封闭液（货号：WR5020） RT 封闭10 分钟；
一抗：兔单抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL检测：RealECL发光液（货号：EC2520），曝光1秒。
使用RTD6140
Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶）产品发表部分文章列表：
1.
[2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of
dimeric chicken complement
component 3d and its binding with
chicken complement receptor 2.
Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang,
Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang
Journal: Developmental and Comparative Immunology 152
(2024) 105109
Institution: Institute
of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.dci.2023.105109