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植物类囊体膜提取试剂盒

植物类囊体膜提取试剂盒

产品编号:RTU5002

产品规格:10次

数量
价格 ¥1500



植物类囊体膜提取试剂盒         Ver.731075

产品编号

产品名称

包装

RTU5002

植物类囊体膜提取试剂盒

10

产品简介:

叶绿体(Chloroplast)是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器,是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜,长径5~10μm,短径2~4μm,厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50~200个叶绿体,可占细胞质的40%,叶绿体的数目因物种细胞类型,生态环境,生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体被膜(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成,含有3种不同的膜:外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔:膜间隙、基质和类囊体腔。类囊体膜上含有光合色素和电子传递链组分,光反应在此上进行,因此类囊体膜也称光合膜。

本公司的植物类囊体膜提取试剂盒采用差速离心方法,可以从植物中提取到高纯度的类囊体膜样品。

1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。

2. 每次处理30 g叶片计算,本产品可使用8-10次提取,每次能得到8-10 mg左右类囊体膜样品。

3. 已经成功用于拟南芥,绿萝,菠菜,豌豆,烟草等植物,还可用于更多植物(可能需要优化条件)。

贮存及运输:

4-8℃保存,至少一年有效;试剂盒常温运输。

产品组成:

产品货号

产品名称

包装

贮存

RTU5002-01

类囊体膜提取缓冲液(

2×250 ml

4

RTU5002-02

类囊体膜漂洗液

100 ml

4

RTU5002-03

类囊体膜溶解液

120 ml

4

RTU5002-04

类囊体膜增溶缓冲液

5 ml

4-8℃;配制后-20℃贮存

RTU5002-05

类囊体膜上样缓冲液(10×)

5 ml

-20

RTU5002-06

BSA

3 g

4

RTU5002-07

过滤纸

50

RT

RTU5002-08

过滤漏斗

一个

RT

RTU5002-09

1 M DTT

2.5 ml

4-8℃;配制后-20℃贮存

 

说明书

-

-

使用说明:

注意:类囊体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用器皿和

溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行,离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究类囊体膜的功能,提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

需要自备材料:

剪刀;50 ml尖底或圆底离心管;15 ml尖底或圆底离心管;匀浆机;低温离心机。

1.1 材料预处理:

叶片在实验前需先用自来水洗净,再用蒸馏水淋洗,去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理,则保存时需要保持叶片湿润,即使如此,叶片采集后的放置时间也不能超过一天。

1.2  1×类囊体膜提取缓冲液(即用型)配制:

 

类囊体膜提取缓冲液(即用型)

配制量150 ml

类囊体膜提取缓冲液(

30 ml

BSA

150 mg

1 M DTT

150 μl

灭菌水

定容至150 ml

 

冰上预冷待用,现用现配,不建议贮存

注:一个30克样品提取反应需要 120 ml 1×类囊体膜提取缓冲液(即用型)。

1.3 叶片匀浆:

1.3.1 新鲜采集植物叶片(约30克),快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在120 ml的预冷的1×类囊体膜提取缓冲液(即用型)中(每克叶片加4 ml)。

1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到电动匀浆机(即家用制备果汁的匀浆机,可选货号:RT-2243A)中,低速匀浆5秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后,再低速匀浆5秒。注意:除电动匀浆机外,还可以选择玻璃匀浆器和研磨(加玻璃珠)等裂解细胞的方法,但这些方法的单次处理量都比较小,需要将样品分成很多小份单独匀浆,然后再汇集。注:不要用液氮研磨,会损伤类囊体膜;不要过度匀浆,把叶片打碎即可,否则会降低类囊体膜得率。

1.3.3过滤匀浆液:2层过滤纸放于漏斗上,用漏斗将滤液收集到预冷的250 ml量筒中,一般分三次收集,总共可收集80-85 ml滤液,将滤液等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中(每个管中的滤液不要超过35 ml)。

1.4类囊体膜收集:

  44200 g离心15分钟,小心弃上清,沉淀即为类囊体膜。

1.5 类囊体膜漂洗:

1.5.1 在类囊体膜沉淀中加入1 ml 预冷的类囊体膜漂洗液,手弹离心管底部使沉淀重悬;再补加1 ml预冷的类囊体膜漂洗液,彻底重悬沉淀。

注:重悬时最好避免溶液起泡,手指轻弹,不要用枪头吹打,否则容易损伤类囊体膜。

1.5.2  410000 g离心2分钟,弃上清,保留沉淀。

1.6 类囊体膜重悬:

1.6.1  沉淀中加入1 ml的类囊体膜溶解液,手弹离心管底部使沉淀重悬;再补加1 ml预冷的类囊体膜溶解液,彻底重悬沉淀。

1.6.2  4℃10000 g离心2分钟,上清为可溶性蛋白(根据实验需要保留),沉淀为类囊体膜组分。

1.6.3 沉淀中加入1 ml类囊体膜溶解液,轻柔重悬沉淀,合并4管溶液,即为最终得到的类囊体膜溶液,约4 ml。

1.7 类囊体膜溶液定量:

通常类囊体膜蛋白含量用单位叶绿素含量来表示,即x μg 叶绿素/ml 类囊体膜溶液。

1.7.1 取5 μl 类囊体膜溶液加入到995 μl 80%丙酮溶液中,混匀。

1.7.2 10000 g 4℃离心2分钟,吸取上清,测定OD663和OD646 吸光值,用80%丙酮做空白对照。

1.7.3 根据以下公式计算叶绿素:

叶绿素浓度(μg Chl/ml)=200×(17.32×OD646+7.18×OD663) 注:200为稀释倍数。

1.8 类囊体膜贮存:

将类囊体膜样品用类囊体膜溶解液稀释到浓度为1mg Chl/ml,根据需要适量分装,如50 μl/管,-80保存。

1.9 类囊体膜样品溶解和电泳:

类囊体膜增溶缓冲液配制:

2.5 ml增溶缓冲液(2×)全部加入到增溶剂粉末中,加入灭菌水定容至5 ml,彻底混匀,即配成5 ml增溶缓冲液,适量分装,-20℃贮存,尽量避免反复冻融。

1.9.1 取50 μl(浓度为1 mg Chl/ml)类囊体膜样品, 4℃ 16000 g离心5分钟,弃上清。

1.9.2 沉淀中加入50 μl类囊体膜增溶缓冲液重悬样品(此时样品浓度为1 mg Chl/ml),轻柔混匀,避免产生大量气泡,冰浴10 min; 4 16000 g离心15 min;上清为绿色,有微量沉淀。 注:如上清为无色,说明增溶不好。

1.9.3 取上清移至新管中(大约可以取到45 μl上清),加入1/10体积的类囊体膜上样缓冲液,BN-PAGE 3-12%或4-16%梯度胶电泳(货号:RTD6139-0312或RTD6139-0416),上样体积5-15 μl。


1.10

 实验示例:







 
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