10×BN转膜缓冲液               Ver.760751-3.0

● 产品简介：

10×BN转膜缓冲适用于BN蛋白电泳后凝胶上非变性蛋白的转膜。本转膜液配制便捷，稀释后无需调节pH值，pH约为7.2-7.7。由于BN电泳凝胶系统的特殊性，BN转膜缓冲液不建议用于传统Tris-甘氨酸系统以及Bis-Tris系统凝胶电泳后的转膜。

该缓冲液最终可配成10升即用型1×缓冲液（根据需求补加甲醇或乙醇）。以每次湿转转膜使用一升溶液计算，改产品可以进行10次转膜实验。

● 贮存、运输及效期：

粉末装常温贮存，常温运输，两年有效；配成10×转膜缓冲液后4℃贮存，一年有效；加入醇的即用型转膜缓冲液4℃贮存，一个月有效；即用型转膜缓冲液不建议重复使用。

● 一. 配制方法：

1.1  10×BN转膜缓冲液（溶液型）配制：

1.2  1×即用型BN转膜缓冲液配制：

注：转膜缓冲液中加入甲醇对蛋白有固定作用，转膜分子量较大的蛋白少加或不加醇，转膜分子量较小的蛋白要加至多20%的醇；为确保转膜效果，转膜缓冲液不建议重复使用。

● 二. 使用方法：

2.1 BN电泳凝胶选择：

BN电泳可以选择Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（货号：RTD6139-0312或RTD6139-0416）。

2.2转膜：

2.2.1转膜方法：BN电泳后的转膜建议用湿转法，不推荐半干转方法。

2.2.2膜的选择：BN电泳转膜必须使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜会与考马斯亮蓝G-250不可逆结合，很难清除干净）。根据蛋白大小选择膜的孔径。一般说来，大于20 kD蛋白选择0.45 μm孔径，低于20 kD选择0.22 μm孔径。PVDF膜使用前要用无水甲醇或乙醇润湿活化。

2.2.3 三明治结构：转膜三明治结构与传统转膜相同，即根据“黑胶白膜”制作三明治，即膜置于转膜夹芯正极一侧，凝胶置于转膜夹芯负极一侧，这样凝胶上带负电荷的蛋白才能转移到膜上。

2.2.4 转膜条件：

由于在非变性条件下，不同蛋白的空间结构，聚合状态，电荷数量都有不同，以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。

注：恒流转膜时，电压不可调节，是变化的，记录电压变化值，如果出现电压剧烈偏差出变化数值，检测转膜体系后排除原因。

2.3 洗膜：

PVDF膜用甲醇或乙醇清洗2-3次，每次3-5分钟，彻底去除蓝色G250（残余G250会影响后续封闭和抗体结合）。

2.4 进行后续WB操作：封闭-一抗-二抗-检测。

三 实验示例：

小鼠线粒体复合物BN电泳后Cocktail抗体检测

样品处理：小鼠肾脏膜蛋白样品 1μg/μl（BN电泳样品制备试剂盒，RTD8304提取），取50 μl 16000g 5 min，沉淀中加入45 μl 膜蛋白重悬液（PN1020M），加5μl 10%DDM（BN2005M），四度旋转30min，16000g 15min，45μl上清中加等体积2×膜蛋白A型上样缓冲液（PL131），浓度为0.5μg/μl上样液，上样10μl和20μl；

凝胶：3-12%RealPAGE Native BN/CN 预制胶（RTD6138-0312），1×蓝色BN电泳缓冲液（1×BC500P+加终浓度0.02%G-250），恒压200V，电泳40 min，至G-250到达距离凝胶下沿1/3

处时，换为1×BC500P（无色），继续电泳35min，至G250到达凝胶底部，结束电泳；

转膜：0.45μm PVDF膜，1×BC600P 不加醇（提前四度预冷1小时），恒流200mA 120 min，电压变化80-95 V，全程冰浴转膜；

洗膜：PVDF膜转膜后结合了G-250，用甲醇漂洗两次，每次5 min；

封闭：快速封闭液常温封闭5min；

一抗：线粒体氧化磷酸化Cocktail抗体 1：1000 （一抗稀释液，WP1080））；

二抗：羊抗兔IgG-HRP 1：5000（二抗稀释液，WS1056）；

检测：RealECL发光液（EC2520），曝光1s480ms。