快速抗体剥离液（免封闭）           Ver.760571-1.0

● 产品简介：

抗体剥离液也称为抗体清除液、印迹膜再生液、抗体洗脱液、Western一抗二抗去除液等，可以高效去除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影响，用于Western中转移了蛋白膜的重复利用，可以实现一膜多敷，即一张膜做多次Western印迹实验（Western Blot reprobing）。

本剥离液采用温和型配方体系，在维持较强抗体剥离能力的同时，能够降低对 NC/PVDF膜结构及膜结合蛋白的扰动，在常温条件下孵育~20分钟通常可以无需封闭即可完成多轮抗体剥离与再检测。本产品兼容NC膜与PVDF膜，与传统高SDS/β-ME体系剥离缓冲液相比，无任何不愉快气味，对NC膜损伤更小，且不易导致PVDF膜透明化。本产品支持多轮抗体剥离与再检测，推荐常规使用 2-4轮检测，对于信号稳定、背景较低的体系，可扩展至 5 轮以上。建议每轮剥离后通过空白ECL或只加二抗检测残留信号，以确认是否适合继续重新检测（reprobing）。在实验示例条件下，NC膜经连续7轮剥离后仍可检测目标蛋白。

为保证剥离效率和降低背景，本产品建议一次性使用，不推荐回收后重复使用。

● 贮存、效期及运输：

   4℃避光贮存；有效期1年；常温运输。

● 用前必读：

1. 理想的抗体剥离液应该是洗脱抗体的同时，不洗脱膜上结合的蛋白或者不改变抗原的结合性质，但是目前没有一种剥离液可以做到只洗脱抗体，而完全不洗脱膜上结合的抗原；也没有一种剥离液可以适用于所有不同亲和度的抗原抗体复合物。剥离液洗脱能力太强，抗原容易被洗脱；太弱，则抗体残留太高。因此，从免疫印迹膜上去除抗体的方案仅能用于定性用途，因为在每个抗体剥离循环中，或多或少都将洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比NC膜更坚韧，因此优先推荐使用PVDF膜用于涉及抗体剥离的实验。

3. 有文献指出转膜后干燥的PVDF膜或NC膜（未结合抗体），可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次抗体剥离的实验。然而，在抗体检测之前，必须使用甲醇将干燥的PVDF膜润湿或用1×TBST将干燥的NC膜润湿。已经结合有抗体的膜，决不能使得膜干燥，否则抗体分子将与膜结合紧密，很难剥离。因此，在做完一轮ECL发光检测实验后，尽快用剥离液清除掉膜上的抗体，推荐将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 检测时，优先检测低丰度抗原，即先孵育条带较弱（表达较低）的蛋白，再孵育条带明显（表达较高）的蛋白，最后再孵育内参。

5. 如条件允许，下一轮的抗体杂交实验选择种属来源不同的一抗（对应不同种属的二抗），减少检测的交叉反应。

6. 该剥离液仅适用于ECL发光检测的膜上抗体清除，不适合于膜上直接显色（DAB，BCIP/NBT等）后抗体的清除，也不适合荧光检测后抗体的清除。

● 使用说明：

1. 在完成ECL化学发光检测后，印迹膜膜在1×TBST中震荡漂洗5分钟，重复漂洗3次，以去除化学发光底物。

2. 弃溶液，加入适量的抗体剥离液，根据下表操作。

3. 弃剥离液，加入足量1×TBST，在摇床上漂洗3次，每次5分钟，把剥离液彻底漂洗干净。

注：残余的剥离液会影响印迹膜后续抗原抗体的的结合，确保要漂洗干净；由于剥离液中含有剥离下来的抗体，不建议重复使用剥离液。

4. 剥离效果验证（可选）：

4.1 直接显影法（空白显影法）-检测HRP残余：漂洗后的已剥离转印膜先不要孵育新的一抗，直接孵育ECL发光液，曝光5-10分钟，膜上看不到发光条带表明二抗清除得比较干净。如果膜上能看到条带，重复步骤2-3。此方法的局限性是只能验证二抗的剥离效果，不能检测一抗的剥离效果。

4.2 功能验证法（只加二抗法）-检测一抗残余：漂洗后的已剥离转印膜，常温孵育二抗一小时，1×TBST漂洗三次，ECL发光检测，无原目的蛋白的特异性条带，表明抗体剥离比较干净；如果原目的条带位置有清晰的信号残余，说明膜上有残余的一抗，重复步骤2-3。

4.3 回检法-检测剥离对抗原影响：建议在多轮剥离与再检测后，重新检测首轮靶标，以评估膜上抗原保留情况。该步骤可作为剥离液温和性与多轮重复检测兼容性的补充验证。

5．处理完后的印迹膜可以无需封闭，可直接进行下一次Western Blot实验。

注1:在多数 Western Blot reprobing 条件下,本产品剥离后无需重复封闭即可进行后续抗体孵育。但对于部分高背景抗体或高灵敏化学发光检测体系，重新封闭有助于降低非特异信号。

注2：剥离后的印迹膜可以置于1×TBS缓冲液（非1×TBST）中，4℃保存。

● 实验示例：

1. NC膜：

2. PVDF膜：