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RIPA裂解液(中)

RIPA裂解液(中)

产品编号:RL1030

产品规格:100ml

数量
价格 ¥200


RIPA裂解液()

产品包装:

产品编号

产品名称

产品包装

说明书

RL0130

RIPA裂解液()

100 ml

1

产品简介:

RIPA裂解液(RIPA  Lysis  Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。RIPA的本意是Radio  Immunoprecipitation  Assay。RIPA裂解液的配方有很多种,根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。RIPA裂解液(中)的主要成分为Tris (pH 7.4), NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS,以及sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多种抑制剂,可以有效抑制蛋白降解。用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品,可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂,不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

保存条件:

-20℃保存,一年有效。

注意事项:

1.为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。需自备PMSF。裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

2. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测与基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

使用说明:

1.  准备RIPA裂解液:

融解RIPA裂解液,混匀;取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。

2. 细胞蛋白提取:

2.1 贴壁细胞:去除培养液,加入适量1×PBS,轻柔漂洗一遍,不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打数下,使裂解液和细胞充分接触,冰上裂解细胞5分钟,用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中,冰上继续裂解15分钟,间歇混匀。

培养板规格/培养皿表面积

细胞量

RIPA推荐使用量

100 mm培养皿

1.5×107

0.5-1 ml

60 mm培养皿

5×106

0.25-0.5 ml

35 mm培养皿

2×106

0.2-0.4 ml

6孔板

2.5×106

100-200 μl

24孔板

5×105

100-150 μl

96孔板

1×105

50-100 μl

2.2 悬浮细胞:450 g 4℃ 离心5 min收集细胞;用适量1×PBS重悬细胞,450 g 4℃ 离心5 min收集细胞;重复漂洗细胞一次;按照细胞沉淀体积(PCV)20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA,混匀细胞沉淀,冰浴处理15分钟,间歇混匀。

注:2×106 Jurkat细胞,其细胞沉淀体积(PCV,Packed Cell Volume)大约为20 μl。

2.3 裂解细胞:

裂解混合物超声波处理(超声条件根据仪器调整,建议条件为);如没有超声破碎仪,可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次(货号:PE2719 ,蛋白提取针头套装),以彻底裂解细胞。冰浴处理15分钟。

注:裂解中细胞会释放出变性的核酸,呈团状粘稠透明样,如不进行超声或针头裂解处理,会导致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和纯度。

2.4 离心收集上清:

充分裂解后,4℃ 16000 g离心10分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

3. 组织样品蛋白提取:

3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,洗净组织血迹,用滤纸吸

干组织表面液体,将组织切成细小的碎片。

3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次,收集匀浆后的裂解混合物,超声波处理(超声条件根据仪器调整,建议条件为);如没有超声破碎仪,可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次(货号:PE2719 ,蛋白提取针头套装),以彻底裂解细胞。裂解物冰浴处理15分钟。

注:裂解中细胞会释放出变性的核酸,呈团状粘稠透明样,如不进行超声或针头裂解处理,会导致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和纯度。

3.4 充分裂解后,4℃ 16000 g离心10分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。


实验示例:

Jurkat RIPA总蛋白提取,GAPDH检测

总蛋白提取:4×106 Jurkat细胞,450 g 离心收集,去上清,PBS漂洗两次,沉淀中加入200 μl RIPA(加2 μl 100 mM PMSF),冰上裂解5分钟,4℃ 16000 g 15 分钟,上清即为总蛋白(TP)。

电泳:RTD6132-15%3.3C  200 V 33-12 mA 55 min

转膜:NC膜,1×RealBlot快速转膜液湿转,稳流400 mA,电压变化64-57 V,转膜时间35 min

封闭:无蛋白快速封闭液,RT 20 min

一抗孵育:GAPDH 羊抗兔多抗,一抗稀释液稀释1:2000

二抗孵育:羊抗兔IgG-HRP,二抗稀释液稀释1:5000

检测:ECL发光检测




 
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