RIPA裂解液(中)                Ver.760856-1.0

● 产品简介：

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP（immunoprecipitation）等。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强（high-strength）、中（moderate-strength）、弱（low-strength）三类。RIPA裂解液(中)（moderate-strength RIPA lysis buffer）的主要成分为Tris (pH 7.4)，NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS等。用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

● 贮存、效期及运输：

-20℃保存；一年有效；湿冰运输。

● 注意事项：

1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。需自备蛋白酶抑制剂如PMSF或磷酸酶抑制剂。裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

2. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测与基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

● 使用说明：

1.  准备RIPA裂解液：

溶解RIPA裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。如做磷酸化蛋白实验，还需要添加磷酸酶抑制剂。

2. 细胞蛋白提取：

2.1 贴壁细胞：去除培养液，加入适量1×PBS，轻柔漂洗一遍，不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解细胞5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中，冰上继续裂解15分钟，间歇混匀。

2.2 悬浮细胞：450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；用适量1×PBS重悬细胞，450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；按照细胞沉淀体积（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混匀细胞沉淀，冰浴处理15分钟，间歇混匀。

注：2×10⁶ Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

2.3 裂解细胞：

裂解混合物超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为20%功率，超3 s停5 s，时间5 min）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次，以彻底裂解细胞；冰浴处理15分钟。

注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。

2.4 离心收集上清：

4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

3. 组织样品蛋白提取：

3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织切成细小的碎片。

3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量) 。

3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次，收集匀浆后的裂解混合物，超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为20%功率，超3 s停5 s，时间5 min）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次，以彻底裂解细胞；裂解物冰浴处理15分钟。

注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。

3.4 4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

4. 实验示例：

Jurkat RIPA总蛋白提取，GAPDH检测

总蛋白提取：4×10⁶ Jurkat细胞，450 g 离心收集，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中加入200 μl RIPA（中）（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解15分钟，超声处理，继续冰浴15分钟，4℃ 16000 g 10 分钟，上清即为总蛋白（TP）；

电泳：RTD6132-15%  200 V 33-12 mA 55 min；

转膜：0.22 μm NC膜，1×RealBlot快速转膜液，湿转，稳流400 mA，转膜时间35 min；

封闭：无蛋白快速封闭液（PF1070），RT 20 min；

一抗孵育：GAPDH 兔多抗，一抗稀释液（WP1080）稀释1：2000；

二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP（HGR1020），二抗稀释液（WS1056）稀释1：5000；

检测：RealECL发光液（EC2520）检测

凝胶：4-18% Tris-甘氨酸预制胶（RTD6119）
样品1制备：2 ml K562细胞（6.5×106/ml），3000rpm 5min，
沉淀用PBS清洗2次，离心后彻底去除PBS，加入130 μl超纯水，100 μl
5×loading buffer(变性，还原)，95度10 min，上样5 μl和10 μl。
样品2制备：2 ml 4K细菌细胞（O/N培养），13000  rpm 5min，
离心后彻底去除残余液体，加入130 μl超纯水，100 μl 5×loading buffer，
95度10min，上样7.5 μl。
样品3-9：1 ml K562细胞（6.5×106/ml），3000 rpm 5 min，
沉淀用PBS清洗2次，离心后彻底去除PBS，加入200 μl各种裂解缓冲液，
冰浴15 min，间歇漩涡震荡40秒（样品9加超声处理2 min），
13000 rpm低温离心10 min，取上清即为总蛋白。加入5×loading buffer(变性,还原)
调整样品浓度为0.2 μg/μl，95度10min，上样10 μl。