植物过氧化物酶POD活性测定试剂盒（微板法）

  Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Microplate Method） Ver.751165-2.0

● 产品组成：

●  产品简介：

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种活性较高、广泛存在于植物组织器官中的氧化还原酶，以铁卟啉为辅基，能催化过氧化氢（H₂O₂）直接氧化酚类或胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，有效防止过氧化氢在体内的积累，从而对植物体起到保护作用；同时，过氧化物酶能使植物组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,是细胞木质素合成途径中间的关键酶。所以，POD与植物体内物质代谢及抗逆性都有着密切关系。

测定原理：用愈创木酚（即邻甲氧基酚，Guaiacol）为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶催化下，过氧化氢可将愈创木酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该物质在470 nm处有最大吸收，故可通过测470 nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。

该试剂盒使用酶标仪，用微孔板测定植物样品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，200 μl反应体系计算，该产品可以大约使用100次。

本试剂盒适用于检测植物组织中的过氧化物酶(POD)活力，不推荐用于动物组织、动物细胞、细菌以及血清样品中POD的检测。

● 贮存、运输及效期：

4℃贮存；常温运输；有效期一年。

● 自备材料：

植物材料；研钵；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；酶标仪（检测波长470 nm）；低温台式离心机；可调式移液器；冰；蒸馏水。

● 实验准备：

1. 酶标仪预热30 min，设定波长到470 nm；

2. 测定前提前30 min取出试剂1、 试剂2和试剂3，平衡至常温（25℃）；

3. 提前打开制冰机。

● 操作步骤：

建议正式实验前，选取2个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免浪费样本和试剂。

一.   样本POD提取：

1.1 取新鲜植物组织，按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为~1：10的比例用研钵进行冰浴研磨，制备成~10%植物匀浆液，如0.1 g 植物叶片，加入1 ml提取液，用研钵进行冰浴研磨。

注：水分充足的样品可以制成5%匀浆液（0.5 g：10 ml）；对于纤维含量多的植物如水稻叶片，可加入适量石英砂（试剂盒不提供，自备）辅助研磨，提高研磨效率；对于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（试剂盒不提供，自备），能有效去除多糖多酚对活性测定的干扰。

1.2 12000 rpm，4℃离心10 min，取上清，即为含有POD的样本，置冰上测定。

注：提取的样本如需贮存，4℃贮存3天；建议按需分装后-80℃贮存，两周内使用，尽量避免反复冻融；不建议-20℃贮存。

二.    样本测定：

2.1 酶标仪程序设置：

确定使用470 nm波长检测；如果酶标仪可以间隔采集吸光值，设定检测程序每1 min读数一次，设定多次读数（一般可以设定5次，时间总长5 min）；如果酶标仪无此功能，记录初始吸光值和终止时间的吸光值。

2.2 在微孔板中依次加入：

2.3 由于植物样本繁多，不同物种的POD活性差异很大，有的物种活性很高（反应启动后混合液颜色很快由橘黄色变为红褐色）；有的物种活性很低（反应启动后 5 分钟内混合液不变色，吸光值只有小数点后三位的变化）。强烈建议先取 2-3 个样本做个预测定，如果反应启动后混合液颜色很快由橘黄色变成红褐色，A1值大于0.6 或 A2 值大于1.5 或ΔA大于1，说明酶活性过高，可降低样本量 x，也可将样本用提取缓冲液稀释后（稀释倍数为D）重新检测。如果 A1 值很小（＜0.05），且△A 很小（＜0.005，随时间延长A470几乎不变化），且反应启动后一段时间没有显色（一般5 min内），说明酶活性很低，可增加样本量x。

三.   活性计算：

3.1 按样本鲜重（FW）计算：

3.1.1 酶活定义：每克植物组织鲜重（FW）每分钟在200 μl反应体系中使470 nm 处吸光值增加1为一个酶活力单位U。

注解：

△A：在时间T内A470的增加值

FW（g）：样本提取中使用植物材料的鲜重克数

T（min）：读取两次A470的间隔反应时间

V总（ml）：样本提取中加入提取液的总体积

V样（ml）：微孔板中加入的样本体积x μl，转换为ml数

D= 样本稀释倍数，未稀释为1

3.1.2 计算示例：

取0.5 克（FW=0.5）绿萝叶片，加入5 ml提取液（V总=5）冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，按照测定步骤操作，取10 μl样本（V样=0.01）测定，三个复孔，设定酶标仪检测波长470 nm，间隔1 min采集数据，采集10次；时间对吸光值做线性回归曲线，4-6 min（T=2）线性较好，2 min内△A=0.225-0.130=0.095。计算POD（U/g FW）=0.095/0.5×1/2×5/0.01×1=47.5 U/g FW

3.2 按样本蛋白浓度计算：

3.2.1 注：此方法需要测定样本的蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号:RTP7102）。

酶活定义：每毫克蛋白（mg prot）每分钟在200 μl反应体系中使 470 nm 处吸光值增加1为一个酶活力单位 U。

注解：

△A：在时间T内A470的增加值

V样（ml）：酶促反应中加入的样本体积x μl，转换为ml数

Cpr：样本蛋白浓度（mg/ml）

T（min）：读取两次A470的间隔时间

D：样本稀释的倍数，未稀释即为1

3.2.2 绿萝POD活性测定-按样本蛋白浓度计算：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量试剂盒（货号：RTP7102）测定蛋白浓度为2 mg/ml（Cpr=2）；按照测定步骤操作，取10 μl样本（V样=0.01）测定，设定酶标仪检测波长470 nm，间隔1 min采集数据，采集5次；时间对吸光值做线性回归曲线，0-5 min（T=5）线性较好，5 min内△A=0.277-0.088=0.189。计算公式： POD（U/mg prot）=0.189/（0.01×2）×1/5×1=1.89 U/mg prot。