植物过氧化物酶POD活性测定试剂盒（微板法）

  Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Microplate Method） Ver.751165-1.0

● 产品组成：

●  产品简介：

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种活性较高、广泛存在于植物组织器官中的氧化还原酶，以铁卟啉为辅基，能催化过氧化氢（H₂O₂）直接氧化酚类或胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，有效防止过氧化氢在体内的积累，从而对植物体起到保护作用；同时，过氧化物酶能使植物组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,是细胞木质素合成途径中间的关键酶。所以，POD与植物体内物质代谢及抗逆性都有着密切关系。

测定原理：用愈创木酚（即邻甲氧基酚，Guaiacol）为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶催化下，过氧化氢可将愈创木酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该物质在470 nm处有最大吸收，故可通过测470 nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。

该试剂盒使用酶标仪，用酶标板测定植物样品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，200 μl反应体系计算，该产品可以大约使用100次。

本试剂盒适用于检测植物组织中的过氧化物酶(POD)活力，不推荐用于动物组织、动物细胞、细菌以及血清样品中POD的检测。

● 贮存、运输及效期：

4℃贮存；常温运输；有效期6个月。

● 自备材料：

植物材料；剪刀；研钵；酶标仪（最佳检测波长470 nm）；酶标板；低温台式离心机；可调式移液器；蒸馏水等。

● 实验准备：

1. 酶标仪预热30 min，设定波长到470 nm。

2. 测定前提前30 min取出试剂1、 试剂2和试剂3，平衡至常温（25℃）。

3. 提前打开制冰机。

● 操作步骤：

建议正式实验前，选取2个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和试剂浪费。

一.   样本POD提取：

1.1 取新鲜植物组织，按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为~1：10的比例用研钵进行冰浴研磨，制备成~10%植物匀浆液，如0.1 g 植物叶片，加入1 ml提取液，用研钵进行冰浴研磨。

注：如果提高研磨效率，可加入适量石英砂（试剂盒不提供，自备）辅助研磨。

1.2 12000 rpm，4℃离心10 min，取上清，即为含有POD的样本，置冰上测定。

注：提取的样本如需贮存，建议按需分装后-80℃贮存，两周内使用，尽量避免反复冻融。

二.    样本测定：

2.1 酶标仪程序设置：

确定使用470 nm波长检测；如果酶标仪可以间隔采集吸光值，设定检测程序每1 min读数一次，设定多次读数（一般可以设定10次，时间总长10 min）；如果酶标仪无此功能，记录初始吸光值和终止时间的吸光值。

2.2 在酶标板中依次加入：

2.3 由于植物样本繁多，不同物种的POD活性差异很大，有的物种活性很高（反应启动后混合液颜色很快由橘黄色变为红褐色）；有的物种活性很低（反应启动后 5 分钟内混合液不变色），吸光值只有小数点后三位的变化。强烈建议先取 2-3 个样本做个预测定，如果反应启动后混合液颜色很快由橘黄色变成红褐色，A1值大于0.6 或 A2 值大于1.5 或ΔA大于1，说明酶活性过高，可降低样本量 V1（如减至 5 μl， 则试剂2相应增加5 μl），改变后的 V1 需代入公式重新计算，也可将样本的提取上清液用提取液稀释 5-10倍后重新检测，计算公式中要乘以相应的稀释倍数（D）。如果 A1 值很小（＜0.05），且△A 很小（＜0.005），且反应启动后一段时间没有显色（一般5 min内），说明酶活性很低，可增加样本量 V1（如增至 20

μl，则试剂2相应减少10 μl），或可延长反应时间 T（如延长到 5 min 后读取 A2），改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。

2.4 若吸光值的上升趋势不稳定，可全部加完所有试剂后读取各个时间点的吸光值，根据时间对

吸光值的线性回归曲线，选取一段线性增长范围读取△A值（参见实验示例）。

2.5 若检测体系不变，可按照样本检测数量，预先把试剂1，试剂2和试剂3按照 40:140:10 比例配成所需体积的混合液，在加样表中直接加一枪 190 μl 混合液即可。

三.   活性计算：

3.1 按样本鲜重（FW）计算：

酶活定义：每克植物组织鲜重（FW）每分钟在200 μl反应体系中使470 nm 处吸光值增加1为一个酶活力单位U。

计算公式：POD（U/g FW）＝ΔA÷(FW×V1÷V)÷T×D

3.2 按样本蛋白浓度计算：

注：此方法需要测定提取液的蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号:RTP7102）。

酶活定义：每毫克蛋白（mg prot）每分钟在200 μl反应体系中使 470 nm 处吸光值增加1为一个酶活力单位 U。

计算公式：POD（U/mg prot） ＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T×D

注解：

V：步骤1.1中加入提取液体积（μl）

V1：步骤2.2中加入样本的体积（μl）

T：步骤2.2读取两次A470的间隔反应时间（min）

FW：步骤1.1中样本鲜重质量（g）

Cpr：步骤3.2中，样本蛋白浓度（mg/ml）

D：步骤2.3中，如果酶活性过高，需要稀释的倍数，未稀释即为1

四. 实验示例：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，按照测定步骤操作，三个复孔，设定酶标仪检测波长470 nm，间隔1 min采集数据，采集10次；时间对吸光值做线性回归曲线，4-6 min线性较好，2 min内△A=0.225-0.130=0.095。

4.2 绿萝POD活性测定-按样本蛋白浓度计算：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量试剂盒（货号：RTP7102）测定蛋白浓度为2 mg/ml；按照测定步骤操作，2个复孔，设定酶标仪检测波长470 nm，间隔1 min采集数据，采集10次；时间对吸光值做线性回归曲线，4-6 min线性较好，2 min内△A=0.206-0.140=0.066。酶活定义： 每毫克蛋白（mg prot）每分钟在200 μl反应体系中使 470 nm 处吸光值增加0.001为一个酶活力单位 U。计算公式：POD（U/mg prot）＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T÷0.001×D；POD（U/mg prot）=0.066÷（10×2）÷2÷0.001×1=1.65 U/mg prot。