2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
● 产品包装：
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组成
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RTQ3101-02
(可做40次50 μl反应)
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RTQ3101-03
(可做200次50 μl反应)
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RTQ3101-04
(可做1000次50 μl反应)
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长期贮存
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2×SYBR qPCR MasterMix
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1ml
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5×1ml
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25×1ml
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-20℃
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RNase-free water
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1 ml
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5×1 ml
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25×1 ml
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-20℃
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注：以50μl qPCR反应体系为例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反应。
● 储存条件: -20℃避光保存；经常使用时，一旦融化后请4℃贮存，4℃保存至少3个月；尽量避免反复冻融。
● 产品简介：
本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR® Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。
本制品使用新型抗体修饰的 HotStart Taq DNA聚合酶，并结合精心优化的反应 Buffer，从而有效抑制低温下的非特异性扩增，提高反应特异性和扩增效率，能够在更宽广的范围内进行准确定量。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。
预混液中含有优化的校正染料，与一系列qPCR设备兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验操作过程中不需要额外添加校准染料来校正仪器。
● 注意事项
1. 本制品中已经含有优化的校正染料，客户无需再添加校正染料，可以直接使用。
2. 本制品含SYBR® Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。
3. 建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4.-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。
5. 模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300 ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。
6. 引物：
建议每条引物工作浓度200 nM-800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
a) 引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%；
b) 扩增片段一般小于300bp，请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低；
c) 如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性；
d) 请尽量选择Tm为65℃～67℃；
e) A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构；
f) 避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避开有2个碱基以上的互补序列；
g) 引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。
此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。
7. 对照设计：
1）No template control（NTC）：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。
2）Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。
● 使用说明：
1. 冰浴中彻底融化2×qMasterMix，避免涡旋震荡，以免产生过多气泡，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。
2. 按照下表在制备反应体系：
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50 μl反应体系
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20 μl反应体系
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终浓度
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2×qPCR MasterMix
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25 μl
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10 μl
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1×
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上游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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下游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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模板
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× μl
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x μl
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10pg-100ng
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水
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补至50 μl
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补至20 μl
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3. 快甩离心将反应液收集到管底。
4. 检测片段大于300 bp，qPCR仪上推荐执行以下程序（三步法）：
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步骤
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温度
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时间
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循环数
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初始变性
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95℃
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30 sec*
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1
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变性
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95℃
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15 sec
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40
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退火
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55-65℃
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30 sec
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延伸
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72℃
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30 sec
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熔解曲线
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使用机器默认采集程序
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检测片段小于300 bp，qPCR仪上推荐执行以下程序（两步法）：
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步骤
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温度
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时间
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循环数
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初始变性
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95℃
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30 sec*
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1
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变性
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95℃
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15 sec
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40
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退火和延伸
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60℃
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60 sec
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熔解曲线
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使用机器默认采集程序
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注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过抗体修饰的，初始变性95℃30 sec即可。
● 实验结果分析
反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。
● 常见问题及处理
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问题
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可能原因
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推荐的解决方法
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无扩增曲线且无扩增产物（凝胶电泳）
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反应体系中有PCR反应抑制剂
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更换或纯化模板DNA。
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引物设计不合理
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重新设计、合成引物。
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逆转录产物体积过量
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减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。
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加样错误或有试剂未加
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检查是否加了所有的所需试剂。
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引物的降解
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通过PAGE电泳检测引物完整性。
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退火温度不正确
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优化退火温度。
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无扩增曲线但有扩增产物（凝胶电泳）
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qPCR仪设置不正确
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检查dye selction，reference dye是否选择正确
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失效的荧光检测
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荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。
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荧光PCR仪问题
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参考qPCR仪器说明书
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阴性对照（NTC）有扩增曲线
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反应体系中有污染
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qPCR片段较小，极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析，解链温度和目的片段相同，凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。
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引物二聚体
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进行溶解曲线分析，如果扩增曲线的解链温度小于80℃，凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。
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提高退火温度3℃。
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PCR效率高于110%
(斜率>-3.1）
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有非特异性扩增
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溶解曲线分析非特异性扩增；优化引物设计
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PCR扩增效率低于90%
(斜率<-3.6)
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反应体系中有PCR反应抑制剂
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更换或纯化模板DNA
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PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。
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确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。
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引物设计
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重新设计引物，避免扩增区域的DNA二级结构。
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实时荧光曲线线性不好
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模板DNA含量较低或过高
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应调整样品的DNA浓度。
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模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质
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对模板DNA进行纯化或更换模板。
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质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA，逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。
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请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。
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CT值高于预期值
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加入的模板量太少
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适当增加模板量。
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样品被降解
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检查样品的完整性。
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引物不合适
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重新设计合成引物。
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CT值低于预期值
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加入了过多的模板
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减少模板量。
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PCR产物太长
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一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp
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CT值的标准差>0.16
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取样不准确
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每种样品的反应混合液单独配制，充分混匀；
qPCR之前要离心，管壁不要沾有反应液。
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ΔRn值太小
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PCR效率太低
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优化PCR反应条件。
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目标模板数太低
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增加模板量。
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扩增曲线的荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状
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PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分，荧光收集不能充分完成。
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适当增加延伸时间。
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以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增，荧光收集量的误差会增大
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应增加反应体积以满足PCR仪器标准。
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