BN电泳样品制备试剂盒（动物组织样品）  Ver260180-1.0

● 产品包装：

● 产品简介：

Blue Native PAGE（BN -PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术，其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从生物膜中以近似天然的状态分离出来，使用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离，由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白（pI＜7）。

    该产品含有BN电泳样品制备及电泳上样所需的试剂，可以在约90分钟内完成动物组织样品中胞浆蛋白和膜蛋白的提取。提取原理：动物组织在裂解缓冲液中匀浆处理得到细胞悬液，离心分离得到上清和沉淀；上清为胞浆蛋白，沉淀为细胞核，线粒体，内质网，未裂解的细胞碎片等；随后用温和去垢剂增溶沉淀，离心后提取增溶后的蛋白（主要包含质膜蛋白，细胞器膜蛋白，核膜蛋白）；提取的蛋白适用于蛋白多聚体分析，酶活测定以及WB检测等。

该产品不建议用于细胞BN样品的制备，细胞BN样品的制备可选择货号：RTD8305。

以每次处理100 mg动物组织样品计算，该试剂盒可以使用50次。

● 保存、效期及运输：

-20℃保存，有效期一年，湿冰运输。

● 使用说明：

自备材料：

1×PBS；1 ml玻璃匀浆器；台盼蓝染色液；蛋白酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；剪刀或刀片； BCA蛋白定量试剂盒；冰浴；低温离心机。

一. 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂如100 mM PMSF（100×）（自备，试剂盒不提供），添加时按照1:100添加。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

3. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

流程图：

二. 提取步骤：

2.1 组织漂洗：

取约100 mg新鲜动物组织，用1×PBS清洗两次，弃净清洗液。

2.2 组织匀浆（关键步骤）：

用剪刀或刀片尽量小心剪切成细小的组织碎片，置于1.5 ml离心管中，先加入0.5 ml裂解液，随后转移到1 ml玻璃匀浆器内冰浴充分匀浆~5次；随后再补加入0.5 ml 裂解液冰浴继续匀浆~5次，每100 mg组织总共需要使用1 ml裂解缓冲液。

注：此匀浆步骤为关键环节。玻璃匀浆器（紧致型）上下推拉一次为一次完整匀浆，匀浆本着宁少勿多，不够再补的原则，不要过度匀浆。匀浆破碎效果与组织类型有关，不同的样品所需匀浆次数不同，软组织如肺，脾脏，肾脏，脑等需要10次左右，硬组织如心脏，骨骼肌等需要15次左右。鉴定方法：取10 μl匀浆后的样品，加入等体积的台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞破碎达到80%即可停止匀浆，请勿过度匀浆。若阳性（蓝色）细胞比例未达到80%，适当增加1-2次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

2.3 胞浆蛋白提取：

2.3.1把匀浆液转移到1.5 ml离心管内，冰浴放置15分钟（间歇混匀）或者4℃旋转混匀15 分钟；

2.3.2 16000 g 4℃离心10分钟，取80%上清保存备用；

注：上清主要包含胞浆蛋白。吸取上清时不要触及沉淀，可以只取80%体积上清，避免和沉淀交叉污染。100 mg组织得到的胞浆蛋白浓度约2-5 μg/μl，不同组织略有不同。

2.4 沉淀样品制备：

2.4.1 彻底去除步骤2.3.2中的上清，100 mg组织得到的沉淀中加入0.5 ml重悬缓冲液，吸头重悬沉淀。注：重悬沉淀时，溶液可能会变粘稠，会有堵吸头现象，经过2.4.2步骤处理后再次重悬。

2.4.2 蛋白溶液中加入5 μl （1/100溶液体积）Benzonase，常温20 min，间歇混匀；

注：加入核酸酶处理能有效降低溶液粘度，提高蛋白得率；此步骤需要常温进行，如低温孵育，需延长时间到40 min。

2.4.3 关键步骤-定量沉淀样品浓度：

BCA方法测定蛋白溶液的蛋白浓度（货号：RTP7102）；

注：必须测定蛋白浓度后再进行如下操作，不能根据经验估算蛋白浓度。

100 mg组织得到沉淀重悬于0.5 ml缓冲液中，蛋白浓度约5-10 μg/μl，不同组织略有不同；

2.4.4 用重悬缓冲液调整蛋白浓度为1 μg/μl。

注：溶液可以按需分装，建议每管50-100 μl，-80℃保存待用；

2.4.5关键步骤-沉淀样品增溶：

取合适体积的蛋白溶液（浓度1 μg/μl），加入1/10体积 10% DDM，轻柔混匀，冰浴30分钟（间歇混匀）或者4℃旋转混匀30 min。如取50 μl蛋白溶液（浓度1 μg/μl），加5 μl 10%DDM。

注：此步骤是把沉淀（包含细胞核，线粒体，内质网以及细胞碎片）中的蛋白（包括膜蛋白）用去垢剂溶解出来，由于去垢剂溶解能力需要和蛋白含量严格对应，故加入溶液体积要精准，不能随意变更。

2.4.6 16000 g 4℃离心15分钟，取上清至一干净1.5 ml离心管中即为增溶后蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的蛋白浓度为1 μg/μl，其中去垢剂DDM终浓度为1%。

三. BN电泳上样液制备：

3.1 胞浆蛋白：

由于胞浆蛋白不含有去垢剂，按照蛋白含量的1/5（质量比）添加考马斯亮蓝G-250染料后进行电泳。举例说明：配制100 μl 浓度1 μg/μl的胞浆BN上样液，内含蛋白100 μg，需要添加20 μg G-250，即添加1 μl 2% G-250。

3.2 沉淀样品：

步骤2.4.6蛋白溶液中加入等体积2×膜蛋白A型上样缓冲液（货号：PL131-01），此时蛋白浓度为0.5 μg/μl，不要加热，上样5-20 μg。

四. BN电泳凝胶选择：

BN电泳可以选用Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(预制胶，通用型)（货号：RTD6139）或Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶）（货号：RTD6140）；转膜缓冲液选择10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）；蛋白Marker可以使用宽分子量非变性电泳蛋白质Marker II（21-880 kD）（货号：RTD6136）。

五. 实验示例：

小鼠组织和Jurkat细胞 BN样品制备电泳图
凝胶：3-12% RealPAGE Native BN/CN 预制胶（RTD6138-0312）；
样品提取：50 mg 冻存小鼠组织，加0.5 ml裂解缓冲液，匀浆10次；四度旋转10min；
16000g 15 min，上清为胞浆蛋白，BCA定量浓度为8 μg/μl；
沉淀中加0.2 ml重悬缓冲液；加入2 μl Benzonase（250U/μl），RT 20 min；
BCA 定量，浓度15 μg/μl，用重悬缓冲液稀释为1 μg/μl；
沉淀样品增溶：取100 μl 重悬蛋白（1μg/μl）+10 μl 10%DDM，四度旋转30min；
16000g 15min，取上清即为增溶后的沉淀样品。
上清样品上样处理：上样液体积100μl（浓度1μg/μl），包含100μg 蛋白（12.5 μl），50 μl 
2×BN/CN上样缓冲液，1μl 2%G-250；上样10μl/10μg； 
沉淀样品上样处理：上样液体积100μl（浓度0.5 μg/μl），取50 μl增溶后的上清加
50 μl PL124，上样10 μl/5μg和20 μl/μg