10%明胶酶谱预制胶（12孔）    Ver.761074-1.0

● 产品简介：

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类锌离子依赖性蛋白水解酶，参与细胞外基质的降解与重塑。其中，MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）能够降解明胶及多种细胞外基质成分，广泛参与胚胎发育、组织修复、炎症反应、肿瘤侵袭与转移等生理和病理过程。MMP-2和MMP-9通常以无活性的酶原形式合成并分泌至细胞外，经蛋白水解加工后可转变为活性形式。明胶酶谱法可同时检测酶原型和活性型MMP-2、MMP-9，并根据其电泳迁移位置进行初步区分。

10%明胶酶谱预制胶采用Tris-甘氨酸体系，凝胶中已经加入明胶底物，可以即拆即用，配合Tris-甘氨酸-SDS电泳对样品进行分离后，方便进行MMP活性检测。

● 贮存、运输及效期：

预制胶4℃贮存，严禁冷冻；其他组份按照试剂盒标签贮存；常温运输；有效期一年。

● 技术规格：

● 使用说明：

一. 电泳缓冲液配制：

5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（5×TGS）配制：将一袋电泳缓冲液粉末（TG120P）加入洁净容器中，加入约 900 mL 超纯水充分溶解，再用超纯水定容至 1000 mL，无需调节 pH， 4℃贮存。将5×TGS用超纯水稀释5倍配成1×TGS进行电泳，如200 mL 5×TGS加入800 mL 超纯水。

二. MMP活性检测样品处理：

MMP-2、MMP-9 主要通过分泌途径进入细胞外环境，因此用于明胶酶谱检测活性时，细胞样品应优先收集培养上清；组织样品则以组织匀浆提取为主，必要时检测组织间液或组织培养上清。与普通 Western blot 不同，明胶酶谱需要保留 MMP 在电泳后恢复酶活的能力。样品制备过程中应避免使用EDTA、EGTA等金属离子螯合剂，以及DTT、β-巯基乙醇、TCEP等还原剂。样品不得煮沸或加热变性，以免影响蛋白酶在电泳后的活性恢复。样品尽量低温处理，分装冻存，避免反复冻融。

2.1培养细胞样品制备：

2.1.1 细胞培养上清（首选，检测胞外MMP）：

适用于 PC-3、DU145、成纤维细胞、肿瘤细胞及其他分泌 MMP 的细胞。

2.1.1.1 细胞培养：

贴壁细胞培养至约70%–90%汇合度，吸去原培养基，使用PBS轻柔洗涤2次，以去除残留血清。

2.1.1.2 收集条件培养基：

加入适量无血清基础培养基，继续培养12–24 h，收集细胞条件培养上清。对于MMP分泌量较低的细胞，可适当延长培养时间，但应避免因细胞死亡造成样品污染。

2.1.1.3 离心去除细胞：

收集上清，4°C、500 × g 离心 5 min；取上清，再以 2,000 × g 离心 10 min，去除细胞及碎片。

2.1.1.4 直接检测或浓缩

上清可直接用于酶谱。当样品中的酶活含量较低时，可使用30 kDa MWCO超滤管浓缩5–20倍。浓缩过程尽量保持低温，并根据样品浓度和实际检测结果调整浓缩倍数。

2.1.1.5 保存：

立即检测，或分装后于 ?80°C 保存。

注：含 FBS 培养基可能产生自身的明胶酶活性带，特别是在约 60–70 kDa 区域。因此，最好使用无血清条件培养基，并设置相同条件下未接触细胞的培养基空白对照。如果细胞无法耐受完全无血清培养，可以使用低血清培养条件，但必须保留培养基空白对照。

2.2 细胞裂解物（检测胞内 MMP）：

虽然 MMP-2、MMP-9 主要在细胞外发挥作用，但细胞内仍可能存在尚未分泌的前体蛋白。

2.2.1 PBS 洗涤细胞 2 次，收集约1×10⁶个细胞。

2.2.2 加入 100 μL 冰冷Western及IP细胞裂解液（不含螯合剂）（WL1020F），冰上裂解 30 min。注：可以加入蛋白酶抑制剂提取蛋白，但不要引入EDTA或EGTA。可选择使用蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA，片剂，通用型)（PC2930）。

2.2.3 4°C 16,000 × g 离心15 min。

2.2.4 收集上清，测定蛋白浓度。

2.2.5 初次实验每孔上样 10–30 μg 总蛋白，根据酶谱结果调整。

2.3 组织样品制备：

组织中的 MMP 不仅存在于细胞内，还可能结合在细胞外基质（ECM）中。因此，组织匀浆中的 MMP 活性既取决于表达量，也取决于提取效率。

2.3.1 组织处理：

取新鲜组织50 mg。冰冷 PBS 快速洗去表面血液，剪碎成约 1 mm3 小块。

注：建议优先使用新鲜组织。冻存组织也可用于明胶酶谱检测，但应避免反复冻融，并注意冻存及解冻过程可能对检测结果产生影响。

2.3.2 加入提取液：

每 50 mg 组织加入 500 μL 冰冷Western及IP细胞裂解液（不含螯合剂）（WL1020F），即约 1:10（w/v）。建议优先使用不含螯合剂的温和型裂解液（WL1020F）。对于难以提取的组织蛋白，可尝试其他裂解条件如使用RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂)（RL0120F），但应验证裂解液对明胶酶谱检测的影响。

注：可以加入蛋白酶抑制剂提取蛋白，但不要引入EDTA或EGTA。可选择使用蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA，片剂，通用型)（PC2930）。

2.3.3 机械匀浆：

使用玻璃匀浆器，在冰上匀浆约 15–30 次，以组织充分破碎为准。尽量避免样品明显升温。

2.3.4 冰上提取：

冰上静置30 min，期间轻轻混匀数次。

2.3.5 离心：

4°C 16,000 × g 离心 15 min，收集上清。保留沉淀供必要时进一步分析。

2.3.6 检测及保存

测定蛋白浓度，初次上样可试每孔 5、10、20 μg 总蛋白。剩余样品分装，-80°C保存。

2.4 样品电泳上样：

2.4.1 将5×蛋白上样缓冲液（变性，非还原）（PL112）常温溶化后混匀。

2.4.2 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。

注：由于MMP活性需要二价阳离子，蛋白样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及还原剂如巯基乙醇，DTT和TCEP等。

2.4.3 快甩离心收集到管底，常温静置10 min，不得煮沸或加热处理，上样电泳。胶原酶阳性对照同时上样5-10 μl（胶原酶阳性对照中胶原酶浓度为20 ng/μl）。

三. 电泳：

3.1 拆开预制胶包装，撕掉底部胶条，拔掉梳子，梳孔朝下轻甩胶板，去除胶孔中可能有的残胶，将预制胶安装在合适的电泳槽中。

注：伯乐Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列电泳槽请确保密封条的安装方向（如右图）。六一其他系列，君意东方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等电泳槽可以直接使用预制胶。不兼容Thermo Fisher Mini Gel Tank 系列电泳槽。

3.2 将电泳槽的内槽加满1×TGS缓冲液，没过梳孔，用1 mL移液器将梳孔吹洗干净，将Marker或蛋白样品（已经过处理）加入点样孔，稳压电泳（表1），至当上样缓冲液中的蓝色示踪染料前沿接近分离胶下沿时停止电泳。

表1 蛋白电泳条件

3.3 拆胶：

使用配套工具撬动胶板（参见右图），小心剥下凝胶。

四. MMP检测：

4.1 漂洗：

取出凝胶，放入容器内，加入适量蒸馏水漂洗凝胶，摇床慢摇5分钟，重复一次。

4.2 复性：

4.2.1 1×复性缓冲液配制：

将10×复性缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如10 mL 10×复性缓冲液加90 mL蒸馏水。

注：如10×复性缓冲液由于低温贮存有析出时，37℃彻底溶化后再使用。

4.2.2 复性：

取出凝胶，弃蒸馏水，加入100 mL 1×复性缓冲液，37℃摇床慢摇30分钟。

注：复性结束后，凝胶呈乳白半透明状。

4.3 孵育：

4.3.1 1×孵育缓冲液配制：

将10×孵育缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如20 mL 10×孵育缓冲液加180 mL蒸馏水。

4.3.2 第一次孵育：

倒掉1×复性缓冲液，加入100 mL 1×孵育缓冲，37℃ 摇床慢摇10分钟；

4.3.3 第二次孵育：

弃1×孵育缓冲液，加入100 mL 1×孵育缓冲液，于37℃缓慢摇动孵育4–16 h。具体孵育时间根据样品中明胶降解酶的活性及反白带显色程度进行调整。

注：阳性对照-胶原酶通常37℃孵育3-4小时即可消化凝胶中的明胶。如样品中MMP 活性低，应延长孵育时间至过夜，孵育过程中注意密封，防止孵育液挥发。

4.4 显色：

4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝胶中加入适量蒸馏水覆盖凝胶，摇床慢摇5分钟，重复一次。

4.4.2 弃蒸馏水，加入适量FastBlue染色液（以刚刚覆盖过胶面为适，需要50-100 mL），摇床上常温摇动30分钟-2小时，凝胶经FastBlue蛋白染色后，未被降解的明胶呈蓝色背景，具有明胶降解活性的区域形成透明或浅色条带。染色结束后使用蒸馏水漂洗，以获得清晰的酶谱图像。

4.5 拍照：

    建议使用透射光源如凝胶观察透射灯（RT3820）拍摄明胶酶谱图像，以提高透明条带与染色背景之间的对比度。拍照时应避免过度曝光，以免影响条带强度的比较。

五. 明胶酶谱结果判读注意事项：

1. MMP-2和MMP-9的酶原型及活化型均可能在明胶酶谱中形成透明条带。透明条带表明该位置存在经复性后能够降解明胶的蛋白酶，不代表样品中的蛋白酶在检测前均处于活化状态。
2. MMP-2的典型条带约为72 kDa（酶原型）和62–66 kDa（活化型）；MMP-9的典型条带约为92 kDa（酶原型）和82 kDa（活化型）。
3. 明胶酶谱并非MMP-2/MMP-9特异性检测方法，其他具有明胶降解能力的蛋白酶也可能产生透明条带。
4. 不同样品之间比较条带强度时，应保持上样量、复性条件、孵育时间和染色条件一致，并避免条带过度降解造成信号饱和。
5. 含血清培养基可能产生背景明胶降解条带。检测细胞培养上清时，建议设置未接触细胞的培养基空白对照。

六. 实验示例：

不同上样量胶原酶阳性对照的明胶酶谱检测结果

凝胶：10%分离胶（含明胶底物）

电泳条件：1×TGS，恒压150 V，电流变化36-12 mA，电泳时间55 min

实验步骤：漂洗-蒸馏水漂洗两次；复性-100 mL 1×复性缓冲液37℃复性30分钟；              孵育-100 mL 1×孵育缓冲液37度孵育10分钟； 100 mL 1×孵育缓冲液37度孵育15小时；漂洗-蒸馏水漂洗两次，每次5分钟；染色-FastBlue染色60分钟；蒸馏水漂洗两次，每次5分钟；

实验结果：胶原酶阳性对照经电泳、复性及孵育后，可在在55-130 kD区间产生明亮明胶降解条带，表现为蓝色背景上的透明或浅色区域。本阳性对照主要用于验证明胶酶谱凝胶及检测流程的有效性，不作为MMP-2或MMP-9的分子量标准。不同样品中的明胶降解条带应结合分子量参考、特异性抑制实验或其他检测方法进行鉴定。