Phos-tag磷酸化检测PAGE凝胶配制及电泳试剂盒(Tris-Gly)   Ver.760857-1.0

● 贮存、效期及运输：

按照标签温度贮存；有效期一年；试剂盒湿冰运输。

● 产品组成：

● 产品简介：

Phos-tag磷酸化检测PAGE凝胶配制及电泳试剂盒(Tris-Gly)提供了可直接用于磷酸化蛋白分离的、基于Tris-Gly体系SDS-PAGE凝胶配制的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制不同浓度的用于磷酸化蛋白电泳检测的PAGE凝胶(Tris-Gly)，无需特异性的磷酸化抗体，仅需常规的目的蛋白抗体就可以进行目的蛋白的磷酸化检测。本产品特别适合用于缺少合适的磷酸化目的蛋白抗体以及研究目的蛋白多位点磷酸化的实验。

磷酸化蛋白电泳检测中的Phos-tag是一种能与磷酸分子特异性结合的功能性分子，可以结合蛋白中含有磷酸化修饰的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸(Ser/Thr/Tyr)残基以及天冬氨酸/赖氨酸/组氨酸(Asp/Lys /His)残基。在用Phos-tag配制的Phos-tag SDS-PAGE凝胶中，蛋白的磷酸化水平越高电泳速度越慢，能根据磷酸化的位点和水平将磷酸化及非磷酸化蛋白分开成不同的条带；同时，具有不同数目和位置的磷酸化形式很多时候也可以分离。此时，使用常规的目的蛋白抗体也能可轻松判断目的蛋白是否有磷酸化修饰，并能确定磷酸化程度以及磷酸化位点的数量。

具体原理参考图1。

图1. Phos-tag-SDS-PAGE磷酸化蛋白电泳检测原理示意图

基于常用的Bis-Tris缓冲体系Tris-Glycine缓冲体系，提供两种 Phos-tag磷酸化检测PAGE凝胶配制试剂盒 (RTD5101/RTD5102)。 Tris-Gly体系与传统的Laemmli方法基本一致，但可分离蛋白种类有限制，分辨率低，并且凝胶建议现配现用；Bis-Tris体系对于磷酸化蛋白的分离能力和分辨率更高，因此可识别的磷酸化形式更多，凝胶配制后可进行冷藏保存（6个月），可根据样品种类和检测需求选择合适的磷酸化蛋白电泳检测的SDS-PAGE凝胶体系。

本试剂盒为基于Tris-Gly缓冲体系的Phos-tag磷酸化检测PAGE凝胶配制试剂盒，提供的凝胶缓冲液采用碱性pH的Tris缓冲液，不含SDS。制备凝胶的浓缩胶为红色上层胶，方便观察梳孔，易于上样。电泳时可使用配套的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液即可进行电泳。

样品裂解液建议使用 EDTA-free、phosphate-free 体系，可加入NaF作为磷酸酶抑制剂；避免 EDTA、EGTA、原钒酸钠（Sodium orthovanadate?）、甘油磷酸钠（β-glycerophosphate）、焦磷酸钠（pyrophosphate）等可能干扰 Phos-tag 结合的成分。

本试剂盒提供了经优化Phos-tag磷酸化检测阳性对照（PT0120），可以通过考染方便判断磷酸化蛋白的检测效果。

本试剂盒约可配制1.0 mm厚度12%凝胶约10块，具体可以配制的凝胶数量和凝胶的厚薄以及凝胶的大小有关。

● 使用说明：

一. 凝胶配制的准备工作。

1.1 准备制胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具，制胶前必须把制胶模具清洗干净。

1.2 10% APS配制-5 ml：

将0.5 g APS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

二. 分离胶配制：

2.1 由于Phos-tag-SDS-PAGE的特殊性，蛋白的迁移率要比常规胶要慢大约20%，根据表1选择凝胶浓度。 表1 不同浓度的Phos-tag-SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：

2.2 按照表2将不同体积的成分在小烧杯中混合；加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

2.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的蒸馏水或无水乙醇，使凝胶表面保持平整。

2.4静置20-40分钟，待分离胶和水或乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。

注：当水（醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。下层胶25℃ ~20分钟可以聚合；18℃ ~40分钟可以聚合。       

注：本试剂盒中的Phos-tag和MnCl₂的工作浓度默认为50 μM Phos-tag和100 μM MnCl₂，如果仍觉得结果不理想，可在此基础上进行优化。试剂盒中提供的Phos-tag溶液(100×)，配制凝胶时较优的使用条件为稀释至1×（终浓度为50 μM），也可根据情况稀释至0.5×（终浓度25 μM）至 2×（终浓度100 μM）进行使用。MnCl₂溶液 (100×)的使用体积需要与实际加入的Phos-tag溶液体积一致（保持Phos-tag和MnCl₂的摩尔比为1：2），凝胶溶液的总体积需维持不变。通常情况下，Phos-tag的浓度越高，凝胶对于磷酸化蛋白的分离能力越强；但相应的，蛋白在凝胶中的迁移速率会降低，整体的迁移距离会变短，又会反过来影响分辨率。

三. 浓缩胶制备：

3.1去除覆盖在分离胶上的水或乙醇层。

3.2按照表3将不同体积成分在一个小烧杯中混合；加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

3.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

3.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

3.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。上层胶25℃ ~30分钟可以聚合；18℃ ~60分钟可以聚合。

表3  Mn-Phos-tag SDS-PAGE浓缩胶（4%）配方表

四. 样品制备：

由于样品的状态会很大程度上影响实验结果，进行样品制备和处理时须注意以下几点：

4.1 确保样品中不含实验干扰物质：避免使用如EDTA，EGTA等金属螯合剂，确认所使用的蛋白酶抑制剂和样品提取裂解液等产品不含EDTA和EGTA；可以使用RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂)（RL0120F）提取样品，结合超声破碎提取，避免使用过于粘稠的样品；蛋白酶抑制剂可以选用PMSF溶液（100 mM）（PM1790）或者蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA，片剂，通用型)（PC2930）。由于多数磷酸酶抑制剂如甘油磷酸钠（Sodium β-glycerophosphate），焦磷酸钠（Pyrophosphoric acid Sodium）和原钒酸钠（Sodium orthovanadate?）都会影响电泳结果，建议不要使用上述磷酸酶抑制剂。可以使用氟化钠（NaF）作为磷酸酶抑制剂。如果结果中条带发生扭曲并确认是由样品中不兼容成分引起，样品可提前用TCA沉淀法进行处理。

4.2 样品上样缓冲液推荐使用5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液（变性，还原）（PL080），该上样缓冲液不含EDTA，已经测试完全兼容phos-tag凝胶。

五. 电泳：

5.1  1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（溶液型）配制：

注：配制好的电泳液建议4℃贮存，使用时间不宜超过两周。回收的电泳液外槽可以重复使用1-2次，内槽建议每次使用新鲜配制的缓冲液。

5.2 电泳条件：

推荐使用恒压 80V进行浓缩胶电泳，随后用150 V进行分离胶电泳，至溴酚蓝前沿到达凝胶底部时结束电泳。

5.3蛋白分子量标准的使用：

由于在磷酸化蛋白SDS-PAGE中，蛋白的迁移速率除了与分子量大小相关外，还与其磷酸化水平有关，因此，预染蛋白分子量标准在Phos-tag SDS-PAGE中不能直接用于推断分子量，但可在电泳中起到粗略指示作用，也可作为转膜效率的参考。通常的预染蛋白分子量标准在Phos-tag SDS-PAGE凝胶中会出现条带弯曲。可以选择使用三色预染蛋白Marker（Phos-tag专用）（RTD6166），该Marker已经测试兼容Phos-tag SDS-PAGE，电泳时不会发生过度弯曲。

六.电泳后的相关分析：

6.1 考马斯亮蓝染色：

电泳后如需进行考马斯亮蓝染色，可按照普通SDS-PAGE凝胶的步骤操作，无需进行特殊处理。染色液可选择使用FastBlue蛋白染色液（RTD6202），然而需要注意的是由于凝胶的特殊性，考染后凝胶背景会深于普通SDS-PAGE凝胶。

6.2 Western Blot检测：

Phos-tag-SDS-PAGE凝胶(Tris-Gly)进行转膜前，必须使用EDTA去除凝胶中的Mn离子，如不去除凝胶中的离子会导致转膜失败。推荐使用经典Tris-甘氨酸转膜缓冲液（TB1040）进行湿转转膜。

6.2.1 将凝胶浸泡于含有10 mM EDTA的1×转膜缓冲液（不含醇）中，摇床摇动孵育10分钟，重复漂洗3次。如果凝胶较厚，可适当延长每次孵育的时间。

6.2.2 凝胶转移到1×转膜缓冲液中（根据蛋白分子量大小添加醇），漂洗5分钟，随后推荐用湿转法转膜。本试剂盒中提供了0.5 M EDTA，可按需进行配制。

● 实验示例：

1. Phos-tag磷酸化检测阳性对照电泳考染结果：

6% Mn-Phos-tag SDS-PAGE检测RC1蛋白磷酸化效果

根据说明书步骤制备6%Mn-Phos-tag SDS-PAGE凝胶，同时使用12%Tris-Gly SDS-PAGE（RTD6119-0012-11）作为对照；两板同时电泳；电泳条件：1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（TG140P）， 80V 10min后调节电压到150V，至溴酚蓝前沿到达凝胶底部，电泳时间共60 min；FastBlue蛋白染色液（RTD6202）染色；RC1为天然磷酸化卵清蛋白（Ovalbumin, OA），RC2为RC1经λ Protein Phosphatase部分脱磷酸化处理所得样品（PT0120，Phos-tag磷酸化检测阳性对照），包含磷酸化和脱磷酸化OA两种形式，在Mn–Phos-tag SDS-PAGE中，RC2分离为两条迁移率不同的条带，其中慢迁移条带对应磷酸化OA，快迁移条带对应脱磷酸化OA（右图）；而在常规Tris-Gly SDS-PAGE中，磷酸化和脱磷酸化OA几乎无法区分（左图）。

2. 4E-BP1 Mn-Phos-tag检测结果：

样品处理：Jurkat 2×10⁷细胞加0.5 ml IP lysis buffer(不含抑制剂，不含螯合剂，加PI，加NaF)，得到蛋白浓度2.6 μg/μl；用脱盐柱（DS0540）去除盐离子（包括去除NaF）；脱盐后的样品用λ PPase消化（200 μg蛋白加300U PPase，30度 2小时）；不加λ PPase的作为酶解对照；TCA沉淀样品后加4×SDS-PAGE上样缓冲液，最后得到200 μl 上样液 1μg/μl ，70度 10min，上样7.5和15μl；

凝胶：12% Tris-Gly SDS-PAGE作为对照平行胶；6%Mn-Phos-tag SDS-PAGE根据试剂盒RTD5102制备；

电泳：1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液，两板同时电泳，80V 20 min后150 V 60 min终止电泳；

洗膜：Phos-tag胶用洗胶缓冲液（1×Tris-甘氨酸转膜缓冲液+10mM EDTA） 10 min 3次；

转膜：两胶同时转膜，转膜缓冲液 1×Tris-甘氨酸转膜缓冲液+20%乙醇，恒流200 mA 冰浴转膜1小时；封闭：3%BSA封闭1小时；

一抗： 4E-BP1 RmAb 1：1000（WP1080稀释）四度双膜背靠背过夜孵育；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 60min；

检测：RealRCL发光液检测，均曝光2 s；

结果：Mn-Phos-tag胶中4EBP1出现明显的快迁移（脱磷酸化）和慢迁移（磷酸化），λ PPase消化的样品全部为快迁移（脱磷酸化）（右图）；常规胶不能分辨磷酸化和脱磷酸化4E-BP1（左图）。

3. 不同浓度Mn-Phos-tag TG凝胶对OA迁移的影响

不同浓度Mn-Phos-tag TG凝胶对OA迁移的影响
1 样品：Phos-tag磷酸化检测阳性对照（PT0120）
2 凝胶：6%Mn-Phos-tag TG凝胶和12%Mn-Phos-tag TG凝胶（Phos-tag 50μM和MnCl2 100μM）
12% TG胶作为平行对照
结果：6% Mn-Phos-tag TG凝胶能够很好分开磷酸化OA和脱磷酸化OA
12% Mn-Phos-tag TG凝胶几乎不能分开
6% Mn-Phos-tag TG凝胶，RTD6166 Marker的70和55粘连在一起