磷酸酶抑制剂混合物（100×）         Ver.760577-1.0

● 贮存、运输及效期：

-20℃保存；湿冰运输；有效期一年。

注：本产品为水系溶液，不含EDTA，长期存放可能会出现微量晶体状沉淀，此为正常现象，常温彻底溶化后混匀使用，不会影响实验结果。

●  产品简介：

磷酸酶抑制剂混合物 (100×) (Phosphatase inhibitor cocktail，100×)是一种用于动物细胞或组织、真菌、细菌以及植物等蛋白提取及其它相关用途的磷酸酶抑制剂混合物，含Sodium fluoride，Sodium orthovanadate，Sodium pyrophosphate和β-Glycerophosphate Sodium等多种磷酸酶抑制剂，可广泛抑制蛋白提取物中的酸性、碱性、丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶(acid, alkaline, Ser/Thr and Tyr phosphatases)活性，保持蛋白原有的磷酸化状态。其中各种组份抑制磷酸酶的种类如下：Sodium fluoride是酸性磷酸酶可逆抑制剂；β-glycerophosphate和Sodium pyrophosphate是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂；Sodium orthovanadate是碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制剂。

本产品使用便捷，通常以1:100的比例把磷酸酶抑制剂混合物加入裂解液中即可用于样品蛋白的提取，并有效抑制蛋白的去磷酸化。

一个包装的本产品通常足够用于100 ml的裂解液的配制。

● 使用方法：

1. 使用前常温溶解磷酸酶抑制剂混合物 (100×)，混匀，按照1：100 比例加入到组织细胞裂解物中，如1 ml裂解物中加入10 μl抑制剂混合物。磷酸酶含量特别丰富的组织，可以适当提高加入量，使其终浓度为2-3×。

注：含有磷酸酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。根据需要，可以同时考虑添加适当的蛋白酶抑制剂混合物。

2. 待所需的抑制剂添加完毕并混匀后，即可开始进行样品的裂解和蛋白提取。

● 1. 酪蛋白脱磷酸化处理 PST检测

样品：酪蛋白钠盐（CR1030） 20mg/ml水溶液；

样品脱磷酸化处理：55 μl酶解体系含100 μg蛋白，加50U CIAP（5μl），不同浓度PPI，水补齐到50μl，加5 μl 10×CIAP buffer， 37度 60min处理，加25 μl 4×变性还原上样缓冲液，20 μl水，70度 10min，此时上样液1 μg/μl，上样10 μl/10 μg；

样品1：原始磷酸化信号-不加CIAP，不加PPI；样品2：脱磷酸化CK-加CIAP，不加PPI；样品3，4，5：加不同浓度PPI，加CIAP，3-加PPI 按照200×稀释； 4-加PPI 按照100×稀释 ；5-加PPI按照50×稀释；样品6：PPI是否影响信号：不加CIAP，PPI按照50×稀释；

凝胶：4-15%RealPAGE Tris-Glycine预制胶（RTD6119-0415-15，1×TGS 200 V 41 min；

转膜：0.45 μm PVDF膜，e-blot仪器转膜，700mA 15min；

封闭：3%BSA（WB1070）RT 封闭1小时；

一抗：PST（Anti-Phospho-Serine/Threonine Rabbit mAb)  1:1000(通用型抗体稀释液，WU1090稀释)四度过夜；

二抗：羊抗兔IgG-HRP（HGR1020，1×TBST） 1：5000 RT 一小时；

检测：RealECL发光液（EC2520） 曝光4 min

结果：

CIAP可显著去除酪蛋白的Ser/Thr磷酸化，PST抗体检测具有磷酸化依赖性；

PPI对CIAP具有一定抑制作用，并呈现一定的浓度依赖趋势；

PPI本身不会影响PST抗体对磷酸化Ser/Thr位点的识别。