植物过氧化氢酶CAT检测试剂盒（钼酸铵分光法）

  Plant Catalase Assay Kit（Ammonium molybdate，Spectrometer Method） Ver.751252-3.0

● 产品组成：

●  产品简介：

植物过氧化氢酶检测试剂盒 (Plant Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测植物体内过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性的试剂盒。测定原理简述如下：样品中的过氧化氢酶（CAT）在过氧化氢相对比较充足的情况下，可以催化过氧化氢产生水和氧气（酶促反应），反应式为：2H₂O₂→2H₂O+O₂；酶促反应后残余的过氧化氢与钼酸铵产生具有吸收波长为405 nm的黄色产物（显色反应），平行对照反应中含有已知浓度的初始过氧化氢浓度，通过计算对照反应与样本反应A405读数的差值，确定酶促反应中有多少过氧化氢被CAT催化分解，根据计算公式计算出样品中CAT活性。

本试剂盒的CAT活性测定特点是从紫外波长（240 nm）转换到可见波长（405 nm）检测，无需使用紫外比色皿或UV微孔板。同时也避免了使用UV测定法中蛋白质在A240吸收对测定结果的严重干扰。

本试剂盒用于检测植物样品中的过氧化氢酶的活性，不推荐用于动物以及体液样品CAT活性的检测。

以使用1 ml显色反应体系计算，该试剂盒共可以进行100次检测。

● 贮存、运输及效期：

4℃贮存；常温运输；有效期6个月。

● 自备材料：

植物材料；研钵；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；1 ml石英比色皿（光程1 cm）（校正过氧化氢浓度用）；1 ml玻璃比色皿（光程1 cm）；紫外可见分光光度计仪（检测波长240 nm和405 nm）；低温台式离心机；可调式移液器；冰；蒸馏水。

● 实验准备：

1. 分光光度计预热30 min，设定波长到405 nm。

2. 取出试剂盒组份，常温放置30分钟，平衡温度至常温。

3. 提前打开制冰机。

● 操作步骤：

一．试剂盒的准备工作：

1.1 测定过氧化氢溶液精确浓度：

本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1 M。由于过氧化氢不是很稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。方法如下：首先把浓度约为1 M的过氧化氢用蒸馏水稀释100倍，使过氧化氢的浓度约为10 mM。随后用如下方法之一测定A240：

1.1.1普通紫外分光光度计法：

使用紫外分光光度计，使用1 ml石英比色皿（光程1 cm），用蒸馏水作为对照，测定A240。

注：用比色皿检测的过氧化氢浓度最接近实际浓度。

1.1.2  96孔紫外酶标仪法(必须能检测240 nm波长)：

根据96孔板的参数确定光程，一般200微升样品的光程为0.552 cm (样品体积除以96孔单孔孔内横截面面积)。一般建议使用专用的96孔紫外检测板(如96孔UV板)，如果没有紫外检测板，也可使用一般的96孔板，但由于不是紫外检测专用板，会有非常高的紫外吸收信号，所以需要设置含等量蒸馏水的孔作为空白对照(一般200 μl水在该类96孔板的A240在3.8左右)，计算时须减去该空白对照。在使用非紫外检测专用板的情况下，由于96孔酶标仪在240 nm的检测上限有限，建议将过氧化氢稀释至约10 mM左右后再进行浓度测定。

注意：以上所有方法都需要设置等量蒸馏水作为空白对照，并在计算时减去该空白对照。

1.1.3 过氧化氢精准浓度计算：

计算公式： c=A/(ε× b)。其中： c为样品浓度(单位为mol/L或M)； A为吸光值； ε为波长依赖的摩尔消光系数(单位为L× mol^-1× cm^-1或M^-1× cm^-1)，过氧化氢的摩尔消光系数为43.6 M^-1cm^-1； b=光程(单位为cm)。过氧化氢浓度(M)=A240/(43.6× b)；即：过氧化氢浓度(mM)=22.94× A240/b。

示例1-微孔板测定浓度：

将本试剂盒提供的约为1 M的过氧化氢用蒸馏水稀释100倍后，用96孔酶标仪，使用普通96孔板进行检测，每孔200微升，每组3个平行。蒸馏水对照组的平均A240为3.750，过氧化氢样品组的平均A240为3.974，差值为0.224， 200微升样品的光程为0.552 cm，代入公式，过氧化氢浓度(mM)=22.94× 0.224/0.552=9.31 mM，则实际本试剂盒提供的过氧化氢浓度为0.931 M。

示例2-石英比色皿测定浓度：

   取蒸馏水1980 μl，加入本试剂盒提供的约为1 M的过氧化氢20 μl（稀释100倍）混匀，取1ml混合液加入到1 ml 石英比色皿中（光程1 cm），用1 ml蒸馏水作为对照，用紫外分光光度计测定混合液的A240=0.435，代入公式，过氧化氢浓度(mM)=22.94×0.435/1=9.98 mM，则实际本试剂盒提供的过氧化氢浓度为0.998 M。

1.2 配制20 μmol/ml（20 mM）过氧化氢溶液：

根据测定得到的实际过氧化氢浓度用检测缓冲液配制成20 μmol/ml（20 mM）过氧化氢溶液，该溶液建议使用棕色管配制，现用现配，4℃避光可以贮存3天。

注：进行一次样品测定，可以配制1 ml 20 mM过氧化氢溶液。

1.3 配制显色底物：

  显色底物提供的是粉末包装，取一瓶粉末装显色底物，加入60 ml蒸馏水，彻底混匀至粉末完全溶解；显色底物溶液配制后4℃避光贮存。

二．样本处理：

1.1 取新鲜植物组织，按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为~1：10的比例进行冰浴匀浆，制成10%匀浆液，如0.1 g 组织，加入1 ml提取液，进行冰浴匀浆；

注：水分充足的样品可以制成5%匀浆液（0.5 g：10 ml）；对于纤维含量多的植物如水稻叶片，可加入适量石英砂（试剂盒不提供，自备）辅助研磨，提高研磨效率；对于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（试剂盒不提供，自备），能有效去除多糖多酚对活性测定的干扰。

1.2 12000 rpm，4℃离心10 min，取上清，即为含有CAT的样本，置冰上待测。

注：提取的样本如需贮存，4℃贮存3天；建议按需分装后-80℃贮存，两周内使用，尽量避免反复冻融；不建议-20℃贮存。

三． 样品测定：

3.1 表一 样品测定流程表（1 ml测定体系）：

3.2 酶促反应：

参考表一，在1.5 ml离心管中，加入溶液，用移液器迅速混匀；25℃ 精确计时反应10分钟。

3.3显色反应：

立即向酶促反应管中加入600 μl显色底物，混匀。

3.4 读数：

25℃孵育10分钟后测定样品A405。

四. 活性计算：

4.1 按照分解过氧化氢微摩尔数计算：

单位定义：在25℃ pH7.0的条件下，在1分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢为1个酶活力单位（U/ml）。

计算公式：CAT活性（U/ml）=

注解：

△标准=A标准-A空白；△测定=A测定-A对照；△A=△标准-△测定

T（min）：10，CAT酶促反应的实际时间为10 min

过氧化氢浓度（μmol/ml）：20，酶促反应中使用的过氧化氢浓度为20 mM（μmol/ml）

V标准（ml）：0.3，酶促反应中加入过氧化氢体积数为300 μl

显色反应总体积（ml）：1，显色反应总体积为1 ml

V样（ml）：酶促反应中加入的样本体积x μl，转换为ml数

D= 样本稀释倍数，未稀释为1

计算示例-绿萝CAT活性测定-按照分解过氧化氢微摩尔数计算：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，按照测定步骤操作，取x=20 μl样本测试，25℃ CAT酶促反应10 min（T=10），加600 μl显色工作液，常温10 min，使用1 ml石英比色皿（光径1 cm），设定分光光度计检测波长405 nm，读数：A标准=1.798，A空白=1.030，A对照=1.111，A测定=1.200，△标准=A标准-A空白=1.798-1.030=0.768，△测定=A测定-A对照=1.200-1.111=0.089，△A=△标准-△测定=0.768-0.089=0.679，CAT活性（U/ml）=0.679/0.768*0.6/0.02=26.5

4.2 按照样本鲜重（FW）计算：

单位定义：在25℃ pH7.0的条件下，每g植物组织每分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢为1个酶活力单位（U/g FW）。

计算公式：CAT活性（U/g FW）=

注解：

△标准=A标准-A空白；△测定=A测定-A对照；△A=△标准-△测定

T（min）：10，CAT酶促反应的实际时间为10 min

过氧化氢浓度（μmol/ml）：20，酶促反应中使用的过氧化氢浓度为20 mM（μmol/ml）

V标准（ml）：0.3，酶促反应中加入过氧化氢体积数为300 μl

显色反应总体积（ml）：1，显色反应总体积为1 ml

V样总（ml）：加入提取液总体积

V样（ml）：酶促反应中加入的样本体积x μl，转换为ml数

W（g）：组织鲜重

D= 样本稀释倍数，未稀释为1

计算示例-绿萝CAT活性测定-按照样本鲜重（FW）计算：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，按照测定步骤操作，取x=20 μl样本测试，25℃ CAT酶促反应10 min（T=10），加600 μl显色工作液，常温10 min，使用1 ml石英比色皿（光径1 cm），设定分光光度计检测波长405 nm，读数：A标准=1.798，A空白=1.030，A对照=1.111，A测定=1.200，△标准=A标准-A空白=1.798-1.030=0.768，△测定=A测定-A对照=1.200-1.111=0.089，△A=△标准-△测定=0.768-0.089=0.679，CAT活性（U/g FW）=0.679/0.768*5/0.02×0.6/0.5=265

4.3 按照蛋白浓度计算：

单位定义：在25℃ pH7.0的条件下，每mg蛋白每分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢为1个酶活力单位（U/mg Pr）。

计算公式：CAT活性（U/mg Pr）=

注解：

△标准=A标准-A空白；△测定=A测定-A对照；△A=△标准-△测定

T（min）：10，CAT酶促反应的实际时间为10 min

过氧化氢浓度（μmol/ml）：20，酶促反应中使用的过氧化氢浓度为20 mM（μmol/ml）

V标准（ml）：0.3，酶促反应中加入过氧化氢体积数为300 μl

显色反应总体积（ml）：1，显色反应总体积为1 ml

V样（ml）：酶促反应中加入的样本体积x μl，转换为ml数

Cpr(mg/ml)：样本蛋白浓度，mg/ml

D= 样本稀释倍数，未稀释为1

计算示例-绿萝CAT活性测定-按照蛋白浓度（mg/ml）计算：

取0.5 克绿萝叶片，加入5 ml提取液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量测定蛋白浓度为0.854 mg/ml；按照测定步骤操作，取x=20 μl样本测试，25℃ CAT酶促反应10 min（T=10），加600 μl显色工作液，常温10 min，使用1 ml石英比色皿（光径1 cm），设定分光光度计检测波长405 nm，读数：A标准=1.777，A空白=1.035，A对照=1.108，A测定=1.231，△标准=A标准-A空白=1.777-1.035=0.742，△测定=A测定-A对照=1.231-1.108=0.123，△A=△标准-△测定=0.742-0.123=0.619，CAT活性（U/mg Pr）=0.619/0.742×0.6/（0.02×0.854）=29.3