● 产品简介：

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体为双凸或平凸透镜，长径5~10μm，短径2~4μm，厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。本公司的植物叶绿体提取试剂盒采用密度梯度离心方法，可以从多种植物中提取高纯度的叶绿体。

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 试剂盒可以用于叶绿体粗提，所得叶绿体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析。也可以用于叶绿体精提，所得叶绿体完整，可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于叶绿体膜，基质，类囊体的提取以及叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。

3. 以每次处理30 g叶片计算，本产品可使用8-10次提取，每次能得到3-5 mg左右叶绿体。

4. 已经成功用于拟南芥，绿萝，菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

● 贮存及运输：

4-8℃保存，至少一年有效；试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

需要自备材料：

剪刀；50 ml尖底或圆底离心管；15 ml尖底或圆底离心管；漏斗；匀浆机；低温离心机。

1.1 材料预处理：

实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片采集后的放置时间也不能超过一天。

1.2  1×叶绿体提取缓冲液（即用型）配制：

注：一个30克样品提取反应需要 150 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）。

1.3 叶片匀浆：

1.3.1 新鲜采集植物叶片，快速去除叶脉（约30克）并将叶片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在150 ml的预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型）中（每克叶片加5 ml）。

1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到匀浆机（货号：RT-2243A）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒，重复10秒匀浆3-4次至叶片破碎即可，不要过分匀浆，否则会降低完整叶绿体的得率。

1.3.3 用2层过滤纸置于小漏斗上，将匀浆液过滤收集到预冷的250 ml量筒中，一般更换三次滤纸可收集约120 ml滤液，将滤液等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 ml）。

1.4  离心去杂质：

4℃ 200 g离心5分钟，沉淀为未破裂植物组织、细胞或细胞核，如果样品中淀粉含量较高，沉淀可能为白色。（右图）

注：此步骤用低速离心去除杂质，不能省略，否则提取的叶绿体会有其他细胞器的污染。

1.5 收集叶绿体粗提液：

1.5.1将步骤1.4得到的上清液平分到4个预冷的50 ml塑料离心管中。

1.5.2 4℃ 1100 g离心15分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体，呈深绿色（右图）。

1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型），手弹离心管底部使叶绿体重悬，收集4管溶液（约6 ml），此溶液即为叶绿体粗提产物（含有破碎的叶绿体和完整的叶绿体），可直接用于后续的SDS-PAGE，Western，蛋白组分析。

注：重悬时最好避免溶液起泡，手指轻弹，不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。

1.6 完整叶绿体的纯化：

叶绿体重悬液配制

1.6.1 单梯度分离法（适合菠菜，白菜，莴苣，拟南芥，绿萝等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml离心管中加入6 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和4 ml密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得40%密度梯度液，冰浴备用。

1.6.1.2将10 ml 40%密度梯度液平分到2个 15 ml离心管中，每管5 ml；将步骤1.5.3得到的叶绿体粗提液3 ml小心铺在5 ml密度梯度液之上；另一管重复。（5 ml 40%密度梯度液用可以分离3 ml 叶绿体粗提液，其他体积以此比例换算）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g离心15分钟，绿色沉淀为完整叶绿体（右图）。

注：如果最上层的分离试剂不够清亮，可以延长离心20分钟。

1.6.1.4 小心弃上清，保留沉淀，每管沉淀中加入1 ml 叶绿体重悬液，轻柔重悬，可以收集到2 ml完整叶绿体溶液。

1.6.2双梯度分离法（适合烟草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml离心管中加入0.8 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度轻液配制-8 ml：

在另一15 ml离心管加入4.8 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得40%密度梯度轻液。

1.6.2.3 取一只15 ml离心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，随后取3.74 ml 40%密度梯度轻液小心铺在80%密度梯度重液之上，冰浴备用；然后取步骤1.5.3得到的3 ml叶绿体粗提液小心铺在密度梯度轻液之上。另一管重复。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分离3 ml 叶绿体粗提液；其他体积按照比例调整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g离心15分钟，上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等，重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体（右图）。

注：如果最上层的分离试剂不够清亮，可以延长离心20分钟。

1.6.2.5 重悬叶绿体：

用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带（完整叶绿体）转移到新的15 ml离心管中，加入三倍体积预冷的叶绿体重悬液，轻柔混匀。

1.6.2.6 离心收集叶绿体：

4℃ 1750 g离心6分钟，小心将上清倒出后，在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的0.5 ml叶绿体重悬液，手指轻弹管底使叶绿体重悬。最终可以收集到1 ml完整叶绿体溶液。

1.7 叶绿体贮存：

叶绿体可在显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体重悬液避光-80℃保存。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于叶绿体膜，基质，类囊体提取以及叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化实验等。

1.8 叶绿素含量测定：

通常叶绿体含量用单位叶绿素含量来表示，即x mg 叶绿素/ml 叶绿体悬浮液。

1.8.1 取10 μl 叶绿体悬浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中，混匀。

1.8.2 3000 g 离心5分钟，取上清测定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮做空白对照。

1.8.3 根据以下公式计算叶绿素：

叶绿素浓度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀释倍数

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

1.9 实验示例：

30克绿萝叶片，加入150 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）匀浆5×10秒，3次过滤共收集120 ml过滤液，平分4管，4℃ 1100 g 离心15 min，弃上清，每管重悬于1.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）中，共得到6 ml 叶绿体粗提液。2×3 ml 粗提液平铺于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g离心15分钟，弃上清，每管沉淀重悬于1 ml 叶绿体重悬液中，共得到2 ml精制叶绿体重悬液，测定叶绿素含量为3.43 mg/ml重悬液。30克叶片提取得到6.86 mg叶绿体。取10 μl叶绿体溶液稀释20倍，取50 μl稀释液显微镜40倍物镜观察，如右图。

RTU5001 植物叶绿体提取试剂盒发表文章列表

1. [2022 IF=7.2] Sufficient potassium improves inorganic phosphate-limited photosynthesis in Brassica napus by enhancing metabolic P fractions and Rubisco activity.

实验植物：油菜

Author: Jinyao Yan, Xiaolei Ye, Yi Song, Tao Ren, Chongming Wang, Xiaokun Li, Rihuan Cong, Zhifeng Lu,Jianwei Lu.

Journal: The Plant Journal (2023) 113, 416–429

Institution：  Huazhong Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16057