DNase I（RNase-free）

●  产品组成：

● 保存： -20℃贮存，有效期一年。

● 产品简介：

DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。 DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下， DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I  可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。该DNase I不含RNase (RNase free)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。

用途：制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA  Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板；DNase I footprinting研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nick translatioin)；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。

● 活性定义：

One unit of the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C. 

● DNaseI贮存缓冲液：

50mM Tris-acetate (pH7.5)，10mM CaCl₂，50% (v/v) glycerol

10×DNase Reaction Buffer：100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，25mM MgCl₂，1mM CaCl₂

● DNaseI失活或抑制：

加入EDTA至终浓度为2.5mM后，65℃加热10分钟可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNase I有显著抑制作用。

● 使用方法：

一 RT-PCR反应前RNA样品中DNA的去除：

 1.在RNase-free离心管中加入以下溶液：

2. 37oC 孵育 30 分钟。

3. 向上述反应体系中加入 1μl 10×EDTA终止液，65oC 孵育 10 分钟以失活 DNase I。

注：在没有鏊合剂如 EDTA存在情况下加热，RNA 可被水解。

4. RNA样品即可直接用作RT-PCR反应的模板。

二 体外RNA反转录后模板DNA的去除：

1.  在每含有0.5 μg模板DNA的反转录反应体系中加入1U DNase I。

注：在某些情况下，模板DNA完全消化所需的DNase的量需通过实验进行摸索。

2.  37oC  孵育15分钟。

3.  酚/氯仿抽提失活DNase I。

三 体外RNA反转录后模板DNA的去除：

1.  参考如下表格设置反应体系：

*3 dNTP Mixture (1mM  each, without the labeled dNTP)：分别取不含已经标记的 dNTP 外的 3 种 dNTP(100mM)  各 1μl 加入到 97 μl 的RNase-free水中混匀即可。例如标记的为 dATP，则需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三种 dNTP 至每种的最终浓度为 1 mM。配制好的 dNTP 可存放于-20oC 以备后续使用。

**DNase I 可以用 1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 进行稀释。

10×Reaction Buffer for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，100mM MgCl₂，10mM DTT。

2. 立即 15oC 孵育 15~60 分钟。

3. 上述反应体系中加入1 μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。

4. 从中取出少量例如1 μl 检测标记效率。通常标记效率至少可以达到 10⁸cpm/μg DNA。