RealPure Bacterial RNA Extraction Kit

RealPure细菌RNA提取试剂盒

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

RNase-free水和溶菌酶4℃保存；其他试剂在常温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。试剂盒常温运输。

● 产品简介：

本试剂盒适用于快速提取细菌总RNA，使用DNA清除柱CS确保有效滤除gDNA残留，不需要使用DNase消化，得到的RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR.。

● 准备工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如500 μl RSL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RSL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇（自备），混匀后盖紧瓶盖后常温贮存备用。

3 按照标签所示在溶菌酶中加入TE溶液，混匀溶解后-20℃贮存。

4 所有离心步骤均在常温下进行。

● 操作步骤：

1. 样品处理和裂解:

1.1 1-2 ml菌液(约10⁸-10⁹细胞)加入到1.5 ml离心管中，13000 rpm 离心2 分钟，弃上清，离心快甩，用移液器吸头尽可能吸尽上清（如果培养基上清去除不完全，将对细胞壁的酶解消化过程产生抑制）。

注：E.coli菌株OD₆₀₀ =0.5 相当于1×10⁹个细菌。

1.2 菌体中加入100 μl酶溶液，涡旋震荡20秒， 按照下表处理。

注：不同细菌破壁难易程度不同，客户根据细菌种类选择合适的酶种类和破壁程序。

1.3 酶解后的菌体中加入500 μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），混匀。

2. 离心得到上清（可选步骤）：

若没有不溶性沉淀，直接进行步骤3。如有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000 rpm离心5 min, 取裂解物上清进行下一步。

3. 去除基因组污染和洗脱RNA：

将DNA清除柱CS放入一干净的2 ml离心管内，用移液器小心将步骤2离心管内的溶液或离心后的上清全部转移到DNA清除柱CS中，13,000 rpm离心2分钟（RNA在离心管滤液中，不要丢弃）。

注：确保全部溶液都收集到2 ml离心管中，如果膜上有残留液体，延长离心时间至5分钟，保证膜上无残留液体。

4. RNA挂柱：

  向2 ml离心管滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇（如滤液体积为500 μl，加入250 μl无水乙醇），此时可能会出现沉淀，立即混匀，不要离心。将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心1分钟。

注：确保溶液全部过滤到收集管中，膜上无残留，如有必要，可以延长离心时间至5分钟。

5. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

6. 去除RNA中的其他杂质：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

7. 进一步去除RNA中的其他杂质：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心1

分钟，弃废液。

8.  关键步骤：彻底去除吸附柱上的残余乙醇：

将吸附柱CR放回收集管中，确保盖好吸附柱管盖，13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟，去除吸附柱上的残余液体。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余漂洗液去除，如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

9. 洗脱得到RNA：

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中，向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃预热可提高洗脱效率），盖好吸附柱管盖，常温放置2分钟，13,000 rpm离心2 分钟。

注：确保水要加到膜的中央，不要贴壁加入；洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

10.  RNA贮存：

RNA样品-80℃中保存。

● RNA产量和质量的评估：

1. RNA产量：

用分光光度计测定OD₂₆₀的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根据以下公式计算：

A₂₆₀×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注：测定OD值时，尽量不要用RNase-free水稀释RNA，因为RNase-free水pH较低，测定的OD值偏低。

大肠杆菌DH5α RNA得率为20-30μg/ml 菌液OD₆₀₀=0.5

2. RNA质量：

凝胶电泳检测：凝胶电泳中，细菌的完整RNA应该有两条主带：26S和13S，并且26S亮度应该与13S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1-1.5 %，可以使用高电压，短时间电泳，如7V/cm电泳，20分钟。建议使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作为Marker。细菌26S rRNA迁移率与800bp类似，13S rRNA迁移率与700bp类似。

吸光值检测：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的数值表示RNA的纯度。纯净的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值应该为2，我们得到的RNA样品比值应在1.8-2.2之间，如果比值低于1.8，表明RNA样品中蛋白污染比较严重。A₂₆₀/A₂₃₀比值应该在2-2.2之间。如果此比值低于2，表明RNA样品中有胍盐的污染。

●  实验示例:

● 问题指南:

1. 离心柱发生堵塞

离心柱发生堵塞之后会造成 RNA 得率降低甚至不能纯化得到 RNA。

常见原因分析如下：

1.1细菌破碎不彻底。

细菌破碎不彻底会使吸附柱发生堵塞，同时会影响 RNA 得率及质量。我们建议在进行细菌破壁时，尽量破碎细菌的细胞壁、细胞膜等组织。

1.2 样本初始量过多。

样本使用量过多会导致裂解液RL plus裂解细胞时不完全，导致离心柱堵塞。该试剂盒处理样本的初始最大量10⁸-10⁹细菌细胞。

1.3 离心机的温度过低。

整个 RNA 分离纯化所有的步骤均在常温（20-25℃）进行。有些低温离心机的温度低于 20℃，可能会造成离心柱的堵塞。如果发生这种现象，请将离心机温度设置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA产量低

通常会有多种因素影响回收效率，比如：样本 RNA 含量、操作方法、洗脱体积等。

常见原因分析：

2.1  样本保存不当或样本保存时间过久导致RNA 已经降解。

建议：新采集的样本应立即放入液氮中速冻，长期保存于-70℃并避免样本的反复冻融；或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂RNAwait溶液中。

2.2  样本破碎裂解不充分导致纯化柱堵塞。

建议：溶菌酶破壁时，确保破壁完全。革兰氏阳性菌注意破壁温度和时间。

2.3  洗脱液添加不正确。

建议：确认 RNase-Free 水滴加到了纯化柱膜O型垫圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中没有添加正确体积的无水乙醇。

建议：请按照说明书，在试剂盒使用前，漂洗液RW中添加正确体积的无水乙醇并混匀。

2.5  组织样本用量不合适。

建议：每 500 μl 裂解液RL使用最大细菌量10⁹，使用过多会导致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 纯度也会降低。我们强烈建议每单次 RNA提取操作，样本初始用量一定不要超过最大建议量。

2.6  洗脱体积不合适或洗脱不彻底。

建议：纯化柱的洗脱液体积为 50-100 μl；若洗脱效果并不理想，建议在加入65℃预热的RNase-Free 水后，延长常温放置的时间，例如放置 5-10 min。

2.7  纯化柱在第二次RW洗涤之后有乙醇残留。

建议：漂洗液RW洗涤后，吸附柱空甩离心2 min是关键步骤，以充分除去吸附柱上残留的乙醇。

3. 纯化获得的RNA有降解

纯化得到的 RNA 的质量和样本的保存、RNase 污染、操作等因素有关。

常见原因分析：

3.1  组织样本采集后没有及时保存。

建议：组织样本在收集后若不及时使用，请立即低温保存于液氮中或经液氮速冻后立即转移至-70℃

长期保存，或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂 RNAwait溶液中。提取 RNA 请尽量使用新近采取的组织样本。

3.2  组织样本反复冻融。

建议：组织样本保存时，最好分装成小份，使用时取出其中一份即可，避免样本的反复冻融导致 RNA 的降解。

3.3  操作间有 RNase 引入或没有佩戴一次性手套、口罩等。

建议：RNA 提取实验最好在单独的 RNA 操作间进行，并在实验前清理好实验桌，实验时佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入导致的RNA 降解。

3.4  试剂在使用过程中被 RNase 污染。

建议：更换新的植物总RNA 提取系列试剂盒进行相关实验。

3.5  RNA 操作时所用的离心管、枪头等有 RNase 污染。

建议：确认 RNA 提取时所用到的离心管、枪头、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始菌体量超过最大建议量

建议：步骤1-样品处理时使用10⁸-10⁹细菌，不要超过最大处理量，否则样品的核酸量会超过DNA清除柱CS的处理极限，导致洗脱下的RNA有基因组DNA的污染。

4.2  省略了步骤3-去除基因组污染步骤。

建议：步骤3-去除基因组污染步骤必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能极大限度的去除上清液中的基因组 DNA，使用裂解液RL plus洗脱下的RNA基本无基因组DNA的污染。

4.3  跳过了使用去蛋白液RD的漂洗步骤（见操作步骤第5步）。

建议：这一步骤对于除去残留的 DNA 以及杂质蛋白十分重要，一定不能省略，否则将会导致纯化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 纯化获得的RNA影响下游实验

经吸附柱纯化的 RNA，如果盐离子、蛋白质含量过多会影响下游实验，比如：逆转录、Northern Blot 等。

1.  洗脱后的 RNA 有盐离子残留。

建议：确认漂洗液RW中添加了正确体积的乙醇，并按操作说明的离心转速进行2次RW洗涤吸附柱 （见操作步骤第6，7步）。

2.  洗脱后的 RNA 有乙醇残留。

建议：确认 RW第二次洗涤后，按操作说明的对吸附柱进行空管离心操作（见操作步骤第8 步），如果还有乙醇残留，可以将空管离心后吸附柱开盖常温放置 5 min，以最大程度上去除乙醇残留。

RNA提取技术问题