RNA提取试剂（目录号：RTR2301）
● 试剂内容：
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名称
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RTR2301
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RNA提取试剂
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100ml
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说明书
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1份
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● 储存、运输及效期：
2-8℃避光保存；常温运输；有效期1年。
● 产品简介：
RNA提取试剂是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，可以提取细菌、植物、动物组织和细胞以及新鲜血液的总RNA。提取的总RNA可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等分子生物学实验。
● 产品特点：
1 分相明显：本试剂为粉红色，便于氯仿分相后区分水相和有机相。
2 结果可靠：该试剂含有强烈抑制RNase活性的物质，可靠保护RNA不降解。
3 价廉物美：其提取效果与国外进口产品相媲美，价格却低于它的三分之一。
● 操作步骤：
实验前需要准备的试剂和耗材：
氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水、RNase-free的耗材（Tip头，离心管等）。
1. 匀浆处理（Homogenization）
1.1组织中提取总RNA：
1.1.1植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1ml RNA提取试剂。
1.1.2动物组织：按10-30mg组织加入1ml RNA提取试剂，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。
1.2 培养细胞中提取总RNA：
1.2.1贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用RNA提取试剂进行裂解，每10cm2培养面积加1ml RNA提取试剂。
1.2.2悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1ml RNA提取试剂可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。
1.3 血液中提取总RNA：
直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后常温放置10分钟，9,000 g离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml RNA提取试剂。
2．分层（Phase Separation）
根据样品，选择使用方法2.1或者方法 2.2。如果不确定，则使用方法2.2。
2.1 (细胞，血液，一般动物组织) – 常温静置 5 分钟，再按照 1 ml RNA提取试剂 使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒离心管以混匀；常温静置 3 -5 分钟使之分层后，4℃12,000g离心 15 分钟。
2.2 (植物，脂肪及肝脏等某些杂质含量较高的样品) – 常温静置 5 分钟后，4℃12,000 g离心 10 分钟，将上清移入另外一个离心管中。再按照 1 ml RNA提取试剂使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒离心管以混匀。常温静置 2 - 5 分钟使之分层后，4℃12,000 g离心 15 分钟。
注：4℃ 离心对于降低基因组 DNA 的污染是很重要的。
杂质含量高的样品一定要使用 2.2 操作。该操作不仅可以将大部分杂质离心去除，也可以将大片段的基因组 DNA 离心去除，方便加入氯仿后的分层，不过，如果想同时抽提总 RNA 和基因组 DNA，则使用 2.1操作。
加入氯仿后的混匀是非常重要的，否则静止分相易出现分相倒置，即水相在离心管下部而有机相在上部。不推荐振荡混匀，而推荐直接用手混匀：将管底斜向朝上，手斜向快速摇动，使体系成粉色乳状。
3．RNA沉淀（RNA
Precipitation）
小心将上层水相（通常可吸取550 μl）移至另外一个离心管中，再加入等体积冰冷的异丙醇混匀，常温放置10 - 20 分钟，4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
注：
中间层和红色下层置于4℃保存，以便接下去抽提基因组 DNA。
用冰冷的异丙醇能更迅速的沉降RNA。
取上层水相时要特别小心，绝对不要吸入白色中间层及红色下层。移取水相时要使用小体积移液器：200 μl 移液器，吸头的尖
嘴要贴在管壁，慢慢松手吸出液体。
对于脂肪类组织，包括脑组织，在上清的最上层为脂肪，取上清时不要吸入，必要时用等体积氯仿对上清再抽提一次。
弃上清后，将离心管置于离心机中快甩离心数秒，再用移液器将残留液体小心吸出。这是最彻底的去除上清的方法，比倒掉上清后再将离心管倒扣在吸水纸上的方法可靠得多。如果是杂质含量高的样品，强烈建议增加此步操作。
4．RNA漂洗（RNA Wash）
4.1 RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml RNA提取试剂加入1ml 75％乙醇。
4.2 4℃7,500 g离心5min，弃上清。
注：转速不要高于7,500g，否则得到的RNA不易溶解。
4.3短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。常温放置1-2分钟晾干沉淀。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
5. 溶解RNA（Redissolving the RNA）
根据需要，沉淀中加入适量（一般可加50-100μl）RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
实验示例：
1.2%琼脂糖胶 1×TAE 150V 25min RealSafe Red预染
RNA提取试剂提取步骤：K562悬浮细胞，1 ml收集（6×106/ml），PBS漂洗两遍，加入1 ml RNA提取试剂，悬浮后常温静置10分钟，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，彻底混匀后静置10分钟，自然分相，4度 13000 rpm 离心15分钟，上清中加入等体积异丙醇，常温静置20分钟，4度 13000 rpm离心15分钟，沉淀用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 离心2分钟，沉淀溶于50μl RNase-free水中。
RTR2306操作简述如下：K562悬浮细胞，1ml收集（6×106/ml），PBS漂洗两遍（平行做2管）。沉淀中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常温裂解5分钟，裂解物加到DNA清除柱CS中，离心收集到2 ml离心管中，离心管中加入0.5倍体积无水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，离心，随后清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最后每个吸附柱用50 μl RNase-free水洗脱，合并两管得到100 μl RNA和100 μl去除的基因组DNA。