动物核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒（组织样品）

Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit for Tissues

● 产品简介：

在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离核蛋白和胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。动物核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒(Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单方便地从组织中抽提细胞核蛋白与胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成组织细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等实验。

本试剂盒是通过裂解缓冲液在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到完整的细胞核（细胞核可以重悬于细胞核贮存缓冲液中 -80℃贮存）；细胞核用核蛋白提取试剂I裂解，配合核酸酶Benzonase消化掉核酸，离心得到变性核蛋白；或者使用核蛋白提取试剂II裂解，离心得到非变性（活性）核蛋白。一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染低于10%。

对于组织样品，如果每个样品的重量不超过50 mg，本试剂盒可以抽提50个样品。

● 产品组成：

● 贮存条件和运输：

根据标签温度贮存；有效期一年；试剂盒湿冰运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂，根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在蛋白提取溶液中（如抑制剂母液是 100×，添加时按照1:100添加）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

3. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

●  使用方法：

一 胞浆蛋白和核蛋白的提取：

1.1准备溶液：常温溶解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的裂解缓冲液A，在使用前加入PMSF溶液和/或磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）和1/1000体积的1 M DTT，随后立即放于冰上待用。

1.2 组织胞浆蛋白提取：

1.2.1把组织尽可能切成非常细小的碎片。

1.2.2按照每50 mg组织加入400 μl裂解缓冲液A（含抑制剂和DTT）的比例在玻璃匀浆器内充分匀浆，匀浆需在冰浴进行，匀浆后吸出匀浆液到离心管中，冰浴5分钟。

1.2.3 关键步骤：加入20 μl裂解缓冲液B（按照裂解缓冲液A体积的1/20加入），混匀，冰浴5-10分钟。

        注1：此步骤尽量不要漩涡震荡沉淀，否则得到的胞浆蛋白可能会污染核蛋白。

注2：裂解缓冲液对不同组织细胞的裂解能力有不同，敏感细胞裂解5分钟足够，其他细胞冰浴时间不要超过10分钟。

1.2.4 4℃ 16000g 离心5分钟，取80%上清即为胞浆蛋白，保存备用。

     注：吸取上清时千万不要触及沉淀，可以只取80%体积上清，以免胞浆蛋白中污染细胞核。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清，其胞浆蛋白浓度约为2-5 mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

1.3 收集细胞核：

1.3.1 彻底去除步骤1.2.4离心管内上清，沉淀中再次加入400 μl裂解缓冲液A（含PMSF

和DTT），用1 ml吸头吹打重悬沉淀至沉淀完全散开（注：涡旋震荡不易悬浮沉淀），冰浴5分钟。

      注：此步骤目的是彻底漂洗沉淀中残余的未裂解细胞，可以大大提高细胞核的纯度。

1.3.2 4℃ 16000g 离心5-10分钟，彻底去除上清，沉淀即为完整的细胞核。

注：尽量完全把上清去除干净，否则细胞核中会污染胞浆蛋白。

1.3.4 可选步骤：取10 μl细胞核溶液，加入10 μl台盼蓝染色液，混匀后，常温放置2分钟，显微镜下观察细胞核的染色情况，提取良好的细胞核为均一蓝色，没有粘连（如图）。

1.4 细胞核蛋白提取：

1.4.1 变性核蛋白提取：

注：此步骤使用含有SDS的核蛋白提取试剂I，完全裂解核膜，释放出细胞核内容物，提取的是完全变性的核蛋白，适用于SDS-PAGE电泳Western Blot检测。

1.4.1.1 取一管50 μl细胞核溶液，4℃ 16000g 离心2分钟，去除上清，保留沉淀。

1.4.1.2 沉淀中加入100 μl核蛋白提取试剂I（变性）（含PMSF和DTT）和1 μl Benzonase，吸头重悬沉淀，37℃处理30分钟至几乎无可见不溶物。

注：加入核蛋白提取试剂I（变性）后，细胞核裂解释放出大量核酸，溶液可能非常粘稠，核酸酶Benzonase可以消化掉核酸，降低粘度。

1.4.1.3 4℃16,000g离心10分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的变性核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。新鲜的50 mg肝脏组织用100 μl提取试剂I裂解后获得的上清，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）测定浓度，其核蛋白浓度约为1-3 μg/μl，不同细胞略有不同。

1.4.2 非变性核蛋白提取：

注：此步骤使用高盐缓冲液（核蛋白提取试剂II）使得细胞核收缩，核酸结合蛋白（如转录因子）与核酸分离，扩散到细胞核外部，离心后上清中为非变性（活性）核蛋白，适用EMSA，转录因子活性分析等实验。

1.4.2.1 取一管50 μl细胞核溶液，4℃ 16000g 离心2分钟，去除上清，保留沉淀。

1.4.2.2 沉淀中加入50 μl核蛋白提取试剂II（非变性）（含PMSF，不要添加DTT），吸头重悬沉淀，4℃旋转混匀30 min，至最后得到的溶液无可见悬浮物。

       注：如不能旋转混匀，可以冰浴30 min，每隔5分钟混匀一次。

1.4.2.3 4℃16,000g离心10分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的活性核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。新鲜的50 mg肝脏组织用50 μl提取试剂II裂解后获得的上清，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）测定浓度，其核蛋白浓度约为1-3 μg/μl，不同细胞略有不同。

二 关于胞浆蛋白和核蛋白产量和质量的评价：

2.1蛋白产量：

2.2 胞浆蛋白和核蛋白质量评价：

蛋白分区提取的质量评价首先看提取的蛋白是否是分区蛋白，其次要看分区蛋白是否有明显的富集，其三要看提出的分区蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的分区蛋白中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的胞浆内参和细胞核内参（下表），可以初步确认提出的是胞浆蛋白还是核蛋白。蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，胞浆蛋白内参或核内参是否有明显富集。交叉污染可以用其他组分内参检测蛋白样品，如关注胞浆蛋白中是否有细胞核蛋白污染，可以使用核蛋白内参如Lamin B1检测胞浆蛋白，检测无条带即说明胞浆蛋白与细胞核组分无交叉污染。用目标蛋白抗体检测分区蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。