三色预染超低分子量蛋白质Marker III（1.2-40 kDa）             

Tricolor Prestained Ultra Low Molecular Weight Protein Marker III（1.2-45 kDa） Ver.761060-1.0

● 储存、运输及效期：

   -20℃贮存；湿冰运输；有效期1年。

● 产品简介：

    本产品由6种经过预染处理的多肽及蛋白质组成，分子量范围为1.2–40 kDa，其中~40 kDa条带为红色，~6.5 kDa条带为绿色，其余条带为蓝色。各条带的标称分子量分别约为1.2、3.4、6.5、15、25和40 kDa。注：预染蛋白及多肽的表观迁移率可能随凝胶浓度和电泳缓冲体系变化，标称分子量仅供参考。

本产品适用于Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳体系，可用于观察电泳过程、判断蛋白质及多肽的迁移位置，并辅助评估Western Blot转膜效果。产品无需加热或额外处理，解冻混匀后即可上样。在推荐的Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶中，可观察到6条预染条带。转膜后的条带可见性受膜孔径、转膜缓冲液及转膜条件影响，低分子量条带应根据实际实验条件进行验证。

每次上样5 μL，250 μL包装可使用50次。

● 使用说明：

1. 第一次收到该产品，常温溶化彻底混匀，离心快甩10秒将溶液完全收集到管底，-20℃贮存；

2. 使用该产品时，常温解冻后轻轻混匀后既能使用，不能95℃加热处理。；

一. 制胶：

多肽电泳建议使用Tris-Tricine-SDS-PAGE系统来分离蛋白，该系统可以分离1-100 kDa的蛋白质（最优分离3-50 kDa）。客户可以使用16.5% RealPAGE Tricine预制胶（货号：RTD6115-0016P）或Tris-Tricine-PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（货号：RTD6122）进行Tricine电泳，方便快捷。或者根据以下程序制备凝胶，先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比约为4.5:1.5:1.5。

1.1 配制分离胶：

1.1.1 按照表一将不同体积的分离胶组份加入到小烧杯中混合。

表一  （一块1 mm 厚度小板胶用量）

注：如非必须，不要使用1.5mm厚度的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混匀。

1.1.3 沿玻璃板内壁缓慢加入适量无水乙醇覆盖凝胶表面，避免扰动凝胶溶液。

1.1.4 静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。分离胶37℃约10分钟，25℃约15分钟，18℃ 约20分钟可以聚合。

1.2 配制夹层胶：

1.2.1 去除覆盖在分离胶上的醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.2.2 按照表一将不同体积的夹层胶组份加入到小烧杯中混合。

1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀使溶液混匀。

1.2.4 在玻璃板中灌入适量夹层胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可，然后在溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。注：此溶液为过量，请勿全部注入，保留制备浓缩胶的位置。

1.2.5 静置20-30分钟，待夹层胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。夹层胶37℃ 20分钟，25℃ 25分钟，18℃ 约30分钟可以聚合。

1.3 配制浓缩胶

1.3.1 去除覆盖在夹层胶上的乙醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.3.2 按照表一将不同体积的浓缩胶组份加入到小烧杯中混合。

1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀，以使溶液充分混匀。

1.3.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.3.5 静置20-40分钟装待凝胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间

会延长。浓缩胶37℃ 20分钟，25℃ 30分钟，18℃ 40分钟可以聚合。

二. 电泳：

2.1 电泳缓冲液配制：

  电泳前，将10×阳极缓冲液（Cat No:AB080）和10×阴极缓冲液（Cat No:CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。

2.2 样品处理：

  待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液(Cat:TP050)等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker混匀后直接上样，不能加热处理。

2.3 电泳：

  将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（电泳条件参考下表）

三. 凝胶检测：

3.1 凝胶染色（FastBlue蛋白染色液）：

3.1.1将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。

3.1.2 弃水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适)，摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。

3. 1.3 摇床上摇动至所有条带清晰可见。

3. 1.4 蒸馏水摇动漂洗脱色1-2次，每次5-10分钟，至凝胶背景干净。

3. 1.5 收集用过的染色液，可以重复使用2-3次。

对于低分子量蛋白及多肽，长时间染色和脱色可能导致部分小分子组分从凝胶中扩散或流失，影响检测效果。建议优先使用FastBlue蛋白染色液（RTD6202），以缩短染色及脱色时间，减少低分子量条带的损失。对于1–3 kDa多肽，应根据实际样品性质及凝胶浓度优化染色条件。

3.2 转膜：

多肽电泳后转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22 μm NC膜。

3.2.1 半干转：使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030），推荐转膜条件:一板小型凝胶(8×10 cm)恒流,1.3 A,10-15 min。

3.2.2 湿转：湿转转膜缓冲液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（货号：TB1040）。推荐转膜条件：恒流200 mA  40-60 min。

注：对于低分子量蛋白及多肽，建议使用0.22 μm孔径的转印膜。转膜效率及膜上保留率受分子量、膜材料、转膜缓冲液及转膜条件影响。特别是低于5 kDa的多肽，应适当优化转膜时间、电流及缓冲液组成，避免转膜不足或过度转膜造成条带损失。

四.小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制：