碘化丙啶染色液（Propidium Iodide Staining Solution）

●  产品组成：

● 产品简介：

碘化丙啶(propidium iodide，PI)，分子式C₂₇H₃₄I₂N₄ ，MW 668.39，CAS：25535-16-4。碘化丙啶不能穿过完整的活细胞膜，即正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对PI拒染，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合，根据此特点，使用PI染色可鉴别死细胞。如果使用PI对活细胞染色必须在染色前进行固定，以增加细胞膜对染料的通透性。PI经常被用来与 Calcein-AM 或者 FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为 535 nm 和615 nm。常用于流式细胞仪分析和显微镜观察，检测细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)。

本产品为 PI 水溶液，浓度为 1 mg/ml（1.5 mM）。使用时根据实验不同直接将本产品用相应溶液稀释到工作浓度。

● 贮存：

-20℃保存，一年有效。

● 操作步骤：

一 悬浮细胞染色

1.1 500 g（2400 rpm，下同）离心收集细胞样品于1.5 ml离心管内，加入0.5 ml固定液（货号：KA5010，卡诺固定液），缓缓悬起细胞，常温固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。

1.2离心去尽固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，洗涤期间手动晃动数次。

1.3 细胞沉淀中加入200μl 1×PBS重悬，加入10 μl 碘化丙啶染色液，37℃避光染色10-15分钟，手动晃动数次。

1.4 离心收集沉淀，重悬于100 μl 1×PBS中。

1.5 取5 μl抗荧光淬灭封片液（货号：AM0510）于载玻片上，加入等体积步骤1.4染色后细胞重悬液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

1.6 荧光显微镜下观察可检测到呈红色的细胞核。激发波长为535 nm，发射波长为615 nm。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

二 贴壁细胞染色

2.1 取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，生长至50%-80%满度。

2.2刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。

2.3去尽固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动。

2.4加入0.5 ml PBS，加入25 μl碘化丙啶染色液，37℃避光染色10-15分钟，手动晃动数次。

2.5去尽染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动。

2.6滴一滴抗荧光淬灭封片液（货号：AM0510）于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。

2.7荧光显微镜下观察可检测到呈红色的细胞核。激发波长为535 nm，发射波长为615 nm。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

● 实验示例：

操作流程： 胰酶消化液消化，计数2×10⁶/ml