细胞凋亡与坏死检测试剂盒

●  产品组成：

● 产品简介：

细胞凋亡与坏死检测试剂盒(Apoptosis and Necrosis Assay Kit)可以快速检测细胞凋亡与细胞坏死。本试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。

按照每个样品细胞数量100万计算，该试剂盒可以使用100次。

● 贮存：

避光按照标签温度保存，一年有效。

● 操作步骤：

一. 贴壁细胞：

1.1在培养液中（细胞数量控制在10⁶以内）均匀滴加适量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，轻柔混匀。例如对于十二孔板中培养的贴壁细胞，每孔有1 ml的培养液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培养液中的血清、酚红等都不会对染色产生干扰。

1.2混匀，37℃培养15分钟，直接在显微镜下观察；如果考虑到液体对拍照的乙酰个，可以吸除含染料的培养液，用染色缓冲液洗涤2-3次即可在荧光显微镜下观察。

注：为避免凋亡细胞随培养液或染色缓冲液被吸除，在吸除液体前，对于用多孔板中培养的细胞，最好用多孔板离心机离心一下以充分沉淀那些已经漂浮起来的凋亡细胞。

二. 悬浮细胞：

2.1 在悬浮细胞培养液中加入适量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，轻柔混匀。例如对于十二孔板中培养的悬浮细胞，每孔有1 ml的培养液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培养液中的血清、酚红等都不会对染色产生干扰。

2.2混匀，37℃培养15分钟，将细胞转移到1.5 ml离心管中，500 g 离心5分钟收集细胞。

2.3细胞沉淀用细胞染色缓冲液洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动。

2.4细胞沉淀中加入100 μl 细胞染色缓冲液，重悬沉淀。

2.5取5 μl抗荧光淬灭封片液于载玻片上，加入等体积步骤2.4染色后细胞重悬液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

2.6 荧光显微镜下观察。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

实验示例：

293 细胞Hoechst/PI双染检测

 操作程序：293细胞胰酶消化后调整细胞密度为1×10⁵/ml。接种到12孔板，1ml每孔，37度5%二氧化碳培养40小时，加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl 碘化丙啶染色液，37度培养15分钟，荧光显微镜观察（40×）。