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GUS染色原理介绍
发表日期:2013/1/24 来源:中科瑞泰(北京)生物科技有限公司   访问次数:

应用较为广泛的报告基因是GUS基因,它来自于大肠杆菌,编码β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶。该酶与5--4--3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid, X-Gluc)底物发生作用,产生蓝色沉淀反应,既可以用分光光度法测定,又可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。检测容易、迅速并能当量。只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。

 

1.GUS酶活性检测

     gus基因存在于某些细菌体内,编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidaseGUS),该酶是一种水解酶,能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性,因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应有。此外,gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达,所产生的融合蛋白仍具有GUS活性,这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件,也是它相对于其他报告基因的一个优点。

主要有以下三种检测方法

1)组织化学染色定位法

    该法以5--4--3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)为底物,通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来,而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温,若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化,表达出GUS,在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质,初始产物并不带颜色,为无色的吲哚衍生物,后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料,此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色,可用肉眼或在显微镜下观察到。

2)荧光法测定GUS活性

    该法以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯(4-MUG)为底物,GUS催化其水解为4-甲基伞形酮(4-MU)及β-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发,产生455nm的荧光,可用荧光分光光度计定量。具体测定时有两种做法:仅在一个时间上测定溶液的总荧光量,测定时要设对照,以消除内源荧光强度;测定酶反应不同时间溶液荧光量(荧光法十分灵敏,微小的增加量也可以测定出来),在酶反应初始阶段,酶作用生成的荧光物质在反应体系中处于积累阶段,荧光产物与时间有线性关系,而内源性荧光物质的荧光量与时间无此种关系,因而可通过测定酶反应初始阶段几个时间的荧光量,得到的线性关系即可作为酶活力的依据。

3)分光光度法测定GUS活性

    对硝基苯β-D-葡萄糖醛酸苷(PNPGluc)是该法的最好底物,GUS将其水解,生成对硝基苯酚,在pH7.15时离子化的发色团吸收400420的光,溶液呈黄色,酶反应在pH7.0条件下进行,随反应进行,产物生成,逐渐碱化,显色增强。以对硝基苯酚为标准样品,分别在反应开始后不同时间取样,终止反应后于415nm测吸收值。这种方法简单,无需复杂仪器,但其灵敏度不高,可通过延长反应时间来增强显色。

X-Gluc 母液配制

20 mg/ml (38mM) X-Gluc. e.g. For a 1.5 ml tube (microfuge tube) dissolve 30 mg  of X-Gluc in 1.5 ml DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF(N,N-dimethylformamide),避光-20℃贮存。


本公司也有GUS染色试剂盒,即用型。


参考文献:

1 标题 Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system

Richard A. Jefferson

Plant Molecular Biology Reporter

文章类型 Experimental Protocols

DOI 10.1007/BF02667740

Volume 5, Number 4 / 198712

作者 Richard A.Jefferson

2 GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.

R A Jefferson, T A Kavanagh, and M W Bevan

EMBO J. 1987 December 20; 6(13): 3901–3907.

 


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